感觉神经缺失对兔下颌骨牵张成骨影响的生物力学观察

　作者：雷德林，王 磊，曹 健，杜兆杰，杨镟凝    作者单位：第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科，陕西 西安 710032

　【摘要】  目的 研究离断下牙槽神经对兔下颌骨牵张成骨新生骨痂生物力学性能的影响。方法 对20只新西兰白兔进行双侧下颌骨牵张成骨，左侧（实验侧）在手术显微镜下暴露并切取约0.6cm下牙槽神经，保护下牙槽血管束，右侧（对照侧）仅暴露下牙槽神经而不切断。术后动物随机分为2组，分别在固定期14、28天取材。对双侧兔下颌骨新生骨痂进行外径测量、苏木精伊红（HE）染色及生物力学测试。应用SPSS12.0软件包进行配对t检验,分析离断下牙槽神经侧与对照侧牵张区新生骨痂上述指标的差异。结果双侧牵张区新生骨痂长度与外径未见明显差异（P>0.05）;离断下牙槽神经侧牵张间隙可见神经组织完全变性，对照侧牵张间隙内神经组织完好。三点弯曲测试显示固定期14、28天时实验侧最大载荷及挠曲强度分别比对照侧低40.1%、26.8%（P<0.05）。结论 离断下牙槽神经可引起牵张区新生骨痂生物力学强度不足，提示感觉神经系统在牵张成骨的成骨过程中起到一定调控作用。

　【关键词】  感觉神经；下颌骨；生物力学

　distraction osteogenesis in rabbits

    LEI Delin,WANG Lei,CAO Jian,et al.

    (Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an  710032,China)

    Abstract：  Objective  To investigate the effects of inferior alveolar nerve resection on mandibular distraction osteogenesis in rabbit.Methods  Twenty new Zealand white rabbits underwent bilateral distraction osteogenesis with a rate of 1mm/d.The inferior alveolar nerve of one side was resected under the surgical microscope,with great care of protecting the inferior alveolar vessel bundle.The contralateral side received sham operations.The rabbits were sacrificed at consolidation time of 14 and 28 days.After three dimension measurements,neoformative callus underwent HE staining and three points bending test.A paired t test was performed using SPSS 12.0 software package.Results  The three dimension measurement of both sides were of no significant difference（P>0.05）.The nerve tissues in the experimental side were severely damaged,whereas the nerve tissues in the control side were intact.Threepoint bending test showed that the bending strength on the denervated side was 40.1% and 26.8% lower than the contralateral side at 14 days and 28 days after consolidation repectively(P<0.05).Conclusion  The inferior alveolar nerve resection can result in mechanical weakness of new bone,thus suggesting that the peripheral nerves play a role during the new bone formation in the distraction osteogenesis.

    Key words:sensory nerve;mandible;biomechanics

    牵张成骨（distraction osteogenesis）是通过特殊的装置，使被切开的骨断端在受到缓慢的牵引力条件下，形成新骨，以延长或拓宽骨骼的外科新技术。由于该项技术在修复创伤后骨缺损及畸形方面具有多种优势，目前在临床应用越来越广［1］。同时，这项技术也为我们提供了一个深入研究骨组织再生与修复的理想模型。

    周围神经系统对于四肢长骨的骨折愈合的影响一直是临床及基础研究的热点问题［2］。但在牵张成骨这一特殊的“骨再生”过程中，周围神经系统尤其是感觉神经，对新骨的形成有何影响，尚未见确切的报道。在下颌骨中，感觉神经即下牙槽神经自下颌孔处进入下颌管，沿下颌骨轴向穿行，并由颏孔穿出。本实验拟通过单侧离断下牙槽神经兔双侧下颌骨牵张成骨模型，研究感觉神经系统对牵张成骨新生骨痂生物力学性能的影响，以期为研究神经系统对骨再生修复的作用提供参考。

     材料与方法

    1  动物模型与分组

    健康成年雄性新西兰白兔20只，体重2.8～3.2kg，购自第四军医大学实验动物中心。氯胺酮（50mg/kg）全身麻醉后，无菌条件下沿颏下中线作长约3.0cm切口并翻瓣，暴露双侧下颌骨颊侧中份骨皮质，保护颏神经，用细裂钻与小骨凿沿第1前磨牙和颏孔之间作垂直骨切开, 放置由西安中邦钛生物材料公司与本课题组共同研制的双侧下颌骨牵张器（图1）。左侧下颌骨（实验侧）于下颌骨下缘角前切迹处凿孔、去骨，在手术显微镜（成都科奥达，ASOM-4）下暴露下牙槽神经血管束，保护下牙槽血管束，分离并切取约0.6cm下牙槽神经，两侧断端反折缝扎（图2）。右侧（对照侧）给予伪操作，即暴露下牙槽神经血管束但不切断。关闭伤口并磨短上切牙。术后3天内给予10%葡萄糖溶液浸泡的半流食，并肌注青霉素20万U/d，3天。牵张参数为：延迟期4天，牵张速率0.5mm/12h，连续牵张10天，牵张总长度为10mm。

    实验动物依照随机化表的方法，随机分为2组，每组各10只（n=10），分别设定为在固定期14、28天处死、取材。在上述2个时间点，分别检测、比较每组动物实验侧与对照侧牵张区新生骨痂的各项指标差异。

    2  标本获取

    实验动物分别于固定期14、28天在全麻下解剖双侧颈总动脉并插管，4%多聚甲醛灌注处死。将双侧下颌骨离体并去除软组织，用游标卡尺测量新生骨痂的实际牵张距离和外径( 包括颊舌径和上下径) ,结果用±s表示。

    3  苏木精伊红（HE）染色

    沿原骨断端外2～3mm完整截取包含邻近正常骨的新生骨痂。所取标本经4%多聚甲醛固定24小时后，10%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA，pH  7.2）脱钙，常规脱水、透明、石蜡包埋，标本沿牵张方向连续水平切片,厚度为4μm。标本切片后，行常规苏木精伊红（HE）染色，光镜下观察。

    4  生物力学检测

    将截取的兔下颌骨新生骨痂连同两侧断端骨质标本以金刚砂片切割的方法制成18mm×6mm×2mm大小的试件（包括完整的颊舌侧骨皮质），切割过程中不断向骨组织滴加生理盐水,在万能电子力学试验机(AGS10kNG,日本SHIMADZU公司)上测定各试件在三点弯曲状态下的应力-应变指标:把试件横向固定于综合试验台上,试件跨度为15mm，在其中点以0.75mm/min速度匀速加载,直到试件断裂,在XY函数记录仪上记载该试件的应力应变曲线,记录试件破坏时的最大载荷并测定各组应力应变曲线线性段的斜率、应力和应变值,计算挠曲强度，计算公式参照第三版《口腔材料学》：δ=3FL/2BH2,其中δ为挠曲强度（MPa），F为最大载荷值（N），L为试件跨距(mm)，B为试件宽度（mm），H为试件高度（mm）。

    5  统计分析

    测量结果用±s表示，运用SPSS12.0软件进行配对t检验，分析离断下牙槽神经侧与对照侧之间各检测指标的差异。P<0.05时认为有统计学差异。

　　结  果

    20只兔均耐受实验过程，双侧下颌骨成功延长，术后动物体重减少均在10%范围内。术后1周内部分实验动物有轻度进食障碍，给予软食，1周后均恢复正常。仅有2只兔在固定期1周后口腔前庭牵张器穿出口腔黏膜处发生感染，经局部处理后好转，不影响实验结果。实验动物经颈动脉灌注处死后，分离双侧下颌骨，大体观察发现全部20只兔的左侧（实验侧）颏神经均严重萎缩，而对照侧颏神经色泽光亮、饱满有弹性。

    1  牵张区新生骨长度与外径

    实验动物牵张间隙内均充满新生骨痂，其长度与外径均未见统计学差异（表1）。

    2  HE染色

    石蜡切片HE染色显示，固定期14天，离断下牙槽神经侧牵张间隙可见神经组织完全变性；对照侧牵张间隙内神经组织完好（图3）。

    3  生物力学检测

    生物力学方法测定牵张区新生骨痂的三点弯曲最大载荷、应力应变曲线线性段的斜率、挠曲强度结果（表2）显示，实验侧的最大载荷及挠曲强度在固定期14天时均比对照侧低40.1%（P<0.05）；在固定期28天均比对照侧低26.8%（P<0.05）。表1  新生骨痂外径测量表2  新生骨痂三点弯曲试验结果

　　讨  论

    大量临床和实验研究表明骨生长修复及再建都受神经系统影响。早在上世纪30年代，Hurrell［3］通过研究成骨细胞附近的神经纤维,就推测这些纤维与骨的塑型和生长有关。通过切除大鼠股神经及坐骨神经，观察其对大鼠胫骨骨折愈合的影响，发现骨折5周后，对照组骨痂达到正常骨质约50%强度，而切除神经组骨痂仅达到正常骨质20%机械强度［4］。另外一些研究表明，感觉神经和自主神经共同支配骨组织，且可能通过释放不同神经肽类递质调节骨组织的代谢活动［5］。但是，对于神经系统在牵张成骨这一特殊的"骨再生"过程中对新骨的形成有何影响，以及其作用机制都尚未明了。本研究组［6］在兔下颌骨牵张成骨模型中局部应用神经生长因子，发现对新生骨痂有明显的促进成骨作用，其作用机制之一可能为神经生长因子诱导感觉和交感神经纤维长入骨痂。

    本实验采用兔双侧牵张成骨模型，内置式牵张器由课题组与西安中邦肽生物材料公司共同研制。此动物模型选择在兔下颌无牙区进行双侧同时牵张,为进行自身双侧对照研究创造了条件。本实验中双侧牵张区新生骨痂三维外径无明显差异，表明此动物模型牵张效果较好，稳定性较高，具有很高的可操作性和可重复性。

    对于失下压槽神经支配模型的建立,文献报道较多,采用的方法也不尽相同［7，8］。Zuniga等［9］在研究三叉神经节对下牙槽神经横切和修复的反应时实验组切断下牙槽神经0.5cm,90天和180天后检测三叉神经节细胞的变化,发现与假手术组间差异有统计学意义,提示下牙槽神经横断0.5cm以上的失神经模型是可行的。本实验将下牙槽神经横断并切除0.6cm长度,两端反折缝扎,更好地防止神经再生结合。

    牵张成骨中新形成的骨组织作为咀嚼功能的力学承载结构,最终将承受咀嚼力的反复加载作用。新骨机械强度的高低是评价骨成熟程度的最可信的指标之一，对骨的材料力学特性的研究包括骨三点弯曲试验、骨压缩试验、骨抗拉试验和扭转试验等多种抗外力试验。本研究采用三点弯曲试验来评价不同处理组牵张区新生骨痂的机械强度，试验结果表明离断下牙槽神经侧下颌骨新生骨痂的生物力学强度较对照侧明显降低，且实验侧与对照侧的差异随着固定期的延长而缩小，推测其原因之一为离断下牙槽神经侧新生骨痂周围骨膜的感觉神经可能逐渐进入牵张间隙（reinnervation）,调控骨的改建过程。

    本实验存在以下局限性：（1）观察周期较短，牵张区新生骨痂达到完全成熟需8周以上时间，本实验未能就此作长期观察。（2）本实验并未对牵张间隙内神经纤维的数量变化做出检测。因此，对于牵张成骨过程中感觉神经对于新骨形成的影响，尚需采用一些特殊手段如免疫组织化学技术等，进行更加深入的研究。

    总之，离断下牙槽神经可引起牵张区新生骨痂生物力学强度不足，提示感觉神经系统在牵张成骨的成骨过程中起到一定调控作用。

【参考文献】  ［1］胡静.颌骨牵张成骨的临床及基础研究［J］.中华口腔医学杂志，2005,40(1):10-12.

［2］GarcíaCastellano JM,DíazHerrera P,Morcuende JA.Is bone a target-tissue for the nervous system? New advances on the understanding of their interactions［J］.Lowa Orthop J,2000,20(1):49-58.

［3］Hurrell DJ.The nerve supply of bone［J］.J Anat,1937,72(1):54-61.

［4］Madsen JE,Hukkanen M,Aune AK,et al.Fracture healing and callus innervation after peripheral nerve resection in rats［J］.Clin Orthop Relat Res,1998，35(1):230-240.

［5］Konttinen YT,Imai S,Suda A.Neuropeptides and the puzzle of bone remodeling［J］.Acta Orthop Scand,1996,67(6):632-639.

［6］Wang L,Zhou SX,Liu BL,et al.Locally applied nerve growth factor enhances bone consolidation in a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis［J］.J Orthop Res,2006,24(12):2238-2245.

［7］Yamashiro T,Fujiyama K,Fujiyoshi Y,et al.Inferior alveolar nerve transection inhibits increase in osteoclast appearance during experimental tooth movement［J］.Bone,2000,26(6):663-669.

［8］Yoshimoto M,Knig B,Allegrini S,et al.Bone healing after the inferior alveolar nerve lateralization: a histologic study in rabbits［J］.J Oral Maxillofac Surg,2004,62(S2):131-135.

［9］Zuniga JR.Trigeminal ganglion cell response to mental nerve t ransection and repair in the rat［J］.J Oral Maxillofac Surg,1999,57(4):427-437.