胸段食管碱烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄动物模型的建立

 作者：周景海，蒋耀光，王如文，范士志  【关键词】  食管损伤；烧伤；食管狭窄；动物模型

　　摘要:  目的  建立家犬胸段食管碱烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄动物模型，探讨NaOH最适致伤浓度。方法  16只家犬随机分为正常对照组（A组）及实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将双根Foley导管插至家犬胸段食管，导管间距10cm，实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别经近侧导管注入5％、10％、20％NaOH溶液各10ml，1分钟后抽出灌注碱液，20ml生理盐水冲洗3次。正常对照组仅注入生理盐水。伤后24小时食管镜检查烧伤程度，2周后行食管钡餐检查，4周后处死家犬，测定食管狭窄指数，行食管组织HE染色，检测组织羟脯氨酸水平。结果  5％NaOH致家犬食管Ⅰ°烧伤，未发生狭窄；20％NaOH致所有实验动物于伤后48小时内死于食管穿孔及急性纵隔炎；10％NaOH均造成家犬食管Ⅱ°b期烧伤，管腔狭窄，食管狭窄指数升高，光镜下胶原纤维增多、粗大、排列紊乱，食管组织羟脯氨酸水平明显增加。结论  建立的家犬胸段食管碱烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄模型方法可靠，操作简便，避免了开胸手术带来的影响。10％NaOH是最佳致伤浓度。

　　关键词：食管损伤；烧伤；食管狭窄；动物模型

　　Establishment of animal models of stricture of thoracic segment of esophagus　caused by alkaline injury

　　ZHOU Jinghai,JIANG Yaoguang,WANG Ruwen,et al.

　　（Center of Thoracic surgery,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing  400042,China)

　　Abstract：  Objective  To establish animal models of stricture of thoracic segment of esophagus after alkaline injury,and to find out  the optimal concentration of NaOH used.Methods   Sixteen dogs were divided randomly into Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ groups.Group A served as the control.Two Foley catheters were inserted into canine thoracic esophagus and adjusted at a distance of 10 cm.Ten ml of 5%,10%,and 20% of NaOH solution was infused through the proximal catheter in the group Ⅰ,Ⅱand Ⅲ respectively.Then the solution was aspirated 1 minute later,and 20 ml of normal saline was used to irrigate the burned area for 3 times subsequently.Saline was instilled in the group A.Rigid endoscopy and barium meal examination were performed 24h and 2 weeks after injury respectively.All the dogs were killed 4 weeks after the experiment.Stricture index and histological feature were observed,and hydroxyproline levels were detected in esophageal tissue.Results  The dogs in the group Ⅰdeveloped Ⅰ°burn injury,and had no esophageal stenosis.All the animals in the group Ⅲ died of esophageal perforation and acute mediastinitis in less than 48h after being burned.Ⅱ° injury was demonstrated under endoscopy in the group Ⅱ.Stricture index and hydroxyproline levels increased significantly in the esophageal tissue.Moreover,histopathological study revealed that collagen deposition and diameter of the fiber increased and its orientation was irregular in the group Ⅱ.Conclusion  The technique is reliable,convenient,and thoracotomy can be avoided.10% of NaOH solution is optimal to establish this animal model.

　　Key words:esophageal injury;burn;esophagus stricture;animal model   　　食管烧伤并非少见，为研究食管烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄的预防和治疗措施，据有关文献报道已建立了多种动物模型，多采用NaOH溶液作为腐蚀剂，这与NaOH为临床上最严重、最常见的腐蚀剂、容易配制且与伤情有量-效关系有关［1，2］。犬是常用的实验动物之一，但现有的建立犬胸段食管烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄模型的方法尚存在一定的缺陷，且对NaOH致伤浓度尚无定论［3，4］，因而本组设计了家犬胸段食管烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄模型，并探讨NaOH最佳致伤浓度。

　　材料与方法

　　1  实验动物及分组

　　体重为12～16kg成年健康家犬16只，雌雄不限，随机分为正常对照组(A组，n=4)及实验组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，n=12），实验组家犬采用NaOH溶液致伤，根据应用NaOH浓度，又分为实验Ⅰ组（5％NaOH致伤）、实验Ⅱ组（10％NaOH致伤）和实验Ⅲ组（20％NaOH致伤），每组各4只家犬。

　　2  动物模型的制作

　　2.1  实验Ⅰ组致伤前禁食12小时，速眠新Ⅱ注射液0.2ml/kg肌肉注射麻醉后，将家犬固定于手术台上，气管插管。行金属食管镜检查，观察有无狭窄、出血及溃疡等，一旦发现病变，则弃用；如无异常，测出胸段食管至犬齿的距离，食管镜下插入引导钢丝至胃内，退出食管镜。将2根16F Foley导管依次套至引导钢丝上，并将导管远端推送至胸段食管内，拔出引导钢丝，调整Foley导管间距为10cm，气囊内注入空气30ml，以固定导管，同时避免扩大烧伤范围。经近侧导管注入5％NaOH溶液10ml，1分钟后抽出灌注碱液，并用生理盐水20ml冲洗3次，释放气囊，取出Foley导管，家犬清醒后拔出气管导管。静脉切开补液3天后恢复进食。观察实验动物的一般情况及消化道症状，每周测体重1次，4周后处死。

　　2.2  实验Ⅱ组10％NaOH溶液致伤，余同实验Ⅰ组。

　　2.3  实验Ⅲ组20％NaOH溶液致伤，余同实验Ⅰ组。

　　2.4  A组生理盐水灌注，余同实验Ⅰ组。

　　3  实验方法

　　3.1  伤后24小时食管镜检查烧伤程度，以后每周检查1次。

　　3.2  分别于致伤前和伤后第2、4周食管钡餐检查狭窄程度。

　　3.3  组织病理学检查

　　3.3.1  取材：家犬烧伤4周后股动脉放血处死，取出胸段食管后剖开，测量烧伤食管壁最大厚度，墨染拓片测出最窄周径，推算出管腔内径，依此计算出狭窄指数（食管壁厚度/内径）。取狭窄处食管组织3块，固定于4％多聚甲醛溶液内，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。另取食管组织于-70℃冻存。

3.3.2  行食管组织HE染色。

　　3.3.3  取出冻存食管组织，匀浆后比色法测定食管组织羟脯氨酸含量。组织羟脯氨酸测试盒购自南京建成生物工程研究所，按说明书进行操作。

　　4  统计学处理

　　所有计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS  10.0进行统计学分析。根据数据性质选择配对或独立样本t检验，多组之间比较用方差分析，检验结果P＜0.05差别显著，P＜0.01差别非常显著。

　　结果

　　1  实验动物的一般情况

　　实验Ⅰ组伤后第1周与伤前相比食欲稍减，但很快恢复，直至活杀前进食正常。实验Ⅱ组伤后第1周食欲欠佳，第2周逐渐恢复进食，但在第3周出现吞咽困难，并进行性加重，至第4周均出现不同程度的反吐，精神萎靡，反应迟钝，但实验动物无死亡。实验Ⅲ组致伤24小时内因食管穿孔及急性纵隔炎死亡3只，另1只伤后第2天死亡。各组家犬实验前、后体重变化见表1。实验前各组之间体重无显著性差异。实验Ⅰ组致伤后第1周体重减轻，但第2周恢复正常，以后直至处死前，其体重与实验前无显著性差别。实验Ⅱ组伤后第1周体重明显减轻，但伤后2周恢复至实验前体重，伤后3周再次减轻，与实验前相比差别非常显著，伤后4周直至处死前体重持续下降。

　　2  食管镜检查

　　实验Ⅰ组致伤24小时后，镜下表现为黏膜充血水肿，第2周基本恢复正常，第3及4周未见明显异常。实验Ⅱ组致伤24小时后食管镜下表现为多个深在或环形溃疡，第2周2只出现黏膜上皮化，其他2只溃疡仍存在，第3周出现不同程度管腔狭窄，第4周狭窄进一步加重。实验Ⅲ组唯一存活＞24小时家犬食管镜下见食管黏膜呈大片黑褐色坏死。

　　3  食管钡餐检查

　　实验Ⅰ组实验前、后食管管径无明显变化，伤后4周与正常对照组无显著性差异。实验Ⅱ组伤后2周钡餐检查食管管径与实验前无显著性差别，但伤后4周不仅发生明显狭窄，与伤后2周相比管腔亦显著缩小。伤后2周实验Ⅰ、Ⅱ、A组食管管径无显著性差别，但伤后4周实验Ⅱ组食管管径与A组相比明显狭窄，与实验Ⅰ组相比亦显著缩小（表2）。

　　4  组织病理学检查

　　（1）大体病理：纵形剖开胸段食管后，实验Ⅰ组食管黏膜稍粗糙，未见明显溃疡或狭窄。实验Ⅱ组均有不同程度管腔狭窄，狭窄范围8~10cm，管壁增厚，其中1只动物见浅表溃疡。实验Ⅲ组见食管穿孔，直径约1～3cm，穿孔周围组织明显炎症水肿，其余食管黏膜呈黑色坏死。（2）食管组织狭窄指数：实验Ⅰ组食管管径、管壁厚度、狭窄指数与正常对照组无显著性差异。实验Ⅱ组与正常对照组、实验Ⅰ组相比，食管管腔缩小，管壁增厚，狭窄指数升高，差别均非常显著（表3）。（3）食管组织HE染色：正常对照组食管包括黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜。实验Ⅰ组食管黏膜上皮仍存在，但细胞层数减少，缺少乳头样结构，黏膜下层腺体减少，肌层及外膜未见明显异常（见图1）。实验Ⅱ组食管黏膜上皮层、固有层及黏膜肌层缺失，黏膜下层腺体明显减少或消失，部分或全部肌层代之以纤维化组织，主要由胶原纤维、成纤维细胞、纤维细胞及少量炎症细胞组成；光镜下胶原纤维呈嗜酸性，粗大，呈波浪形，排列紊乱或呈网状，有分支（见图2）。实验Ⅲ组主要表现为急性炎症反应，黏膜层、黏膜下层溶解、坏死，肌细胞水肿、断裂，肌细胞之间明显出血、水肿，大量嗜中性粒细胞、巨噬细胞浸润（见图3）。

　　5  食管组织羟脯氨酸水平

　　检测了A组、Ⅰ组及Ⅱ组食管组织内羟脯氨酸的水平，结果见表4。Ⅰ组羟脯氨酸水平与A组无显著性差异。Ⅱ组食管组织羟脯氨酸水平不仅高于A组，与Ⅰ组相比亦明显增高，有非常显著统计学差异。

　　表1  实验前后家犬体重变化（略）

　　与实验前相比：★P＜0.05，★★P＜0.01；与正常对照组相比：▲▲P＜0.01

　　表2  致伤前后食管钡餐检查最窄管径（略）

　　与伤前相比：▲P＜0.01；与伤后2周相比：★P＜0.01

　　表3  烧伤4周后食管狭窄指数变化（略）

　　与正常对照组相比：▲P＜0.01；与实验Ⅰ组比较：★P＜0.01

　　表4  烧伤4周后食管组织内羟脯氨酸水平（略）

　　与正常对照组相比：▲P＜0.01；与实验Ⅰ组相比：★P＜0.01

　　图1  实验Ⅰ组家犬食管烧伤4周后组织学表现（HE×200）（略）                          

　　图2   实验Ⅱ组家犬食管烧伤4周后组织学表现（HE×200）（略）                             

　　图3  实验Ⅲ组家犬食管烧伤致死后组织学变化（HE×200）（略）                            

　　讨论

　　现主要有2种建立犬食管烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄的动物模型的方法：(1)将1根导管插至直立位犬的下胸段食管，注入10％NaOH溶液，1分钟后再用0.1N的盐酸中和［3］；(2)开胸游离下胸段食管5cm，脐肠带阻断其上、下端，将1根导管自口腔插至拟烧伤区，以30cmH2O恒压下注入20％NaOH溶液60秒，同等压力下蒸馏水冲洗食管3次，每次15秒［4］。尽管这2种方法分别建立于上世纪50及70年代，现仍用于食管烧伤的研究［5］。但上述方法有一定缺陷：(1)第一种方法将导管插至食管后直接注入NaOH，腐蚀剂易反流发生误吸，引起呼吸道烧伤，死亡率增加，同时易出现胃灼伤，造成幽门狭窄，影响对实验动物的长期观察；(2)第二种方法需开胸手术，加大了实验动物的创伤，增加了并发症的发生率，而食管的游离一定程度破坏了血液循环，有别于正常食管对腐蚀剂的反应，对实验结果的观察产生不利影响。为避免以上缺陷，我们将2根Foley氏导管分别插入胸段食管，导管间距为10cm，气囊膨胀后能使腐蚀剂局限于拟烧伤区，不仅阻止其反流烧伤呼吸道，而且避免了胃灼伤，这种方法操作简便，避免了开胸手术。食管烧伤的严重程度与腐蚀剂的浓度、量及作用时间有关。Thompson［1］将3.8% NaOH 溶液1ml注入家兔胸段食管，结果实验动物体重减轻，食管管腔减小，烧伤组织内羟脯氨酸含量增加。Ashcraft等［2］采用8.3％NaOH烧伤实验动物，病理学检查发生明显的炎症反应，粘膜浅层脱落，全层血管栓塞。其他作者［4，6，7］报道建立食管烧伤后瘢痕狭窄动物模型采用10%～20％NaOH，烧伤时间为60秒，致伤时间＜60秒时一般不易发生明显食管狭窄［7］。我们在预实验中用20％NaOH溶液20ml致伤食管60秒，结果实验动物全部死亡，因而将腐蚀剂量减为10ml，根据腐蚀剂浓度分为3组，以探讨相同剂量及作用时间下，建立中国家犬胸段食管烧伤后瘢痕挛缩致管腔狭窄模型的最适浓度。结果5％NaOH致伤家犬4周后，食管无明显狭窄；20％NaOH溶液致伤后，4条家犬均于48小时内死亡；而10％NaOH烧伤后食管体重明显减轻，钡餐及病理组织学检查发生了明显的食管狭窄。食管烧伤后是否发生瘢痕挛缩和增生与烧伤程度有关。食管烧伤与皮肤烧伤相似，其中Ⅱ°烧伤又分为Ⅱ°a期及Ⅱ°b期，Ⅰ°及Ⅱ°a期烧伤一般不形成管腔狭窄，Ⅱ°b期及Ⅲ°烧伤多发生食管管腔狭窄［8］。烧伤早期食管镜检查是判断食管烧伤程度的主要方法。我们伤后24小时对实验动物均行食管镜检查，发现实验Ⅰ组均为Ⅰ°烧伤，实验Ⅱ组为Ⅱ°b期烧伤，而实验Ⅲ组中唯一存活超过24小时家犬为Ⅲ°烧伤。致伤4周后食管钡餐检查及墨染拓片均发现实验Ⅱ组家犬出现明显的食管管腔狭窄，其狭窄指数与正常对照组、实验Ⅰ组相比明显升高。食管烧伤与其他创伤相似，早期表现为急性炎症反应。伤后数小时内，深度烧伤可表现为急性炎症、水肿及坏死，伤后3天内损伤部位由白细胞及纤维蛋白形成的假膜覆盖，如损伤超过肌层则可能发生食管穿孔，成纤维细胞4天后迁移至创伤部位，伤后第5天，食管黏膜表面假膜开始脱落，创伤10天后即开始组织修复［9］。组织修复过程中主要表现为成纤维细胞合成大量细胞外基质，胶原是细胞外基质的主要成分，创面愈合过程中胶原代谢状况可反映其对创面愈合的调控规律。成纤维细胞在粗面内质网内合成的前胶原是一种可溶性蛋白，其中的脯氨酸经内质网中的脯氨酰羟化酶羟化，形成羟脯氨酸，成为胶原纤维的重要组成部分。羟脯氨酸几乎是胶原所特有［10］，在胶原中羟脯氨酸占恒定的比例，可作为组织中胶原含量的标志，测定组织中羟脯氨酸水平间接反映组织中胶原含量，创伤组织中羟脯氨酸含量升高表明胶原合成和沉积增加。我们发现实验Ⅱ组家犬食管组织内羟脯氨酸含量明显增加，与实验前、正常对照组、实验Ⅰ组差别均非常显著。光镜下胶原密度明显增多，胶原粗大，排列紊乱。因而，实验Ⅱ组家犬伤后4周发生瘢痕挛缩和管腔狭窄与组织内胶原纤维合成及沉积明显增加有关。

参考文献：

　　［1］Thompson JN.Corrosive esophageal injuries. II.An investigation of treatment methods and histochemical analysis of esophageal strictures in a new animal model［J］.Laryngoscope,1987,97(10):1191-1202.

　　［2］Ashcraft KW,Padula RT.The effect of dilute corrosives on the esophagus［J］.Pediatrics,1974,53(2):226-232.

　　［3］Bosher LW Jr,Bufrord TH,Ackerman L.The pathology of experimentally produced lye burns and strictures of the esophagus［J］.J Thorac Surg,1951,21(5):483-489.

　　［4］Butler CⅡ,Madden JW,Davis WM,et al.Morphologic aspects of experimental esophageal lye strictres I. Pathogenesis and pathophysiologic correlations［J］.J Surg Res,1974,17(4):232-244.

　　［5］蒋耀光，杜冬松，李志平，等.糖皮质激素及异烟肼预防食管碱性烧伤后瘢痕狭窄的实验研究［J］.中华创伤杂志,1995,11(3):161-163.

　　［6］Davis WM,Madden JW,Peacock EE Jr.A new approach to the control of esophageal stenosis［J］.Ann Surg,1972,176(4):469-476.

　　［7］Fell SC,Denize A,Becker EH.The effect of intraluminal splinting on the prevention of caustic stricture of the esophagus［J］.J Thorac Cardiovasc Surg,1966,52(5):675-681.

　　［8］Satar S,Topal M,Kozaci N.Ingestion of caustic substances by adults［J］.Am J Ther,2004,11(4):258-261.

　　［9］Mamede RC,de Mello Filho FV.Ingestion of caustic substances and its complications［J］.Sao Paulo Med J,2001,119(1):10-15.

　　［10］Grant ME,Prockop DJ.The biosynthesis of collagen［J］.N Engl J Med,1972,286(4):194-199.