人参多糖对移植性人白血病模型小鼠作用观察
发表时间：2009-09-10 浏览次数：1382次
陈地龙,李 静,刘永刚,王亚平,王建伟,郑 敏,姜 蓉 (重庆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室,重庆市生物化学与分子药理学实验室,重庆400016) 提 要:目的 建立重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠人白血病模型,观察人参多糖在体内对白血病细胞的药理学作用。方法 在SCID小鼠尾静脉分别接种K562细胞建立SCID小鼠人白血病模型,应用组织细胞化学、RT-PCR、流式细胞术、组织病理监测在给予人参多糖前后白血病模型SCID小鼠的外周血、骨髓、肝、脾中的白血病细胞。结果 SCID小鼠人白血病模型外周血象在疾病早期无明显变化,第18天白细胞数略有升高,光镜下可检测到1% ~4%人白血病细胞,病程后期,白细胞明显增高,血涂片检查人白血病细胞占10%;经GPS注射后, SCID小鼠一般状况明显好于对照组,其肺、肾等脏器的炎症及病理变化减轻。结论 人参多糖在体内能有效地治疗髓系白血病,且未发现有明显的毒副作用。 关键词:人参多糖; K562;白血病动物模型 中图法分类号:R-332;R282. 71;R733. 7 文献标识码:AEffect ofG inseng polysaccharide on human leukem ia SCID mousemodelCHEN Di-long,LI Jing,LIUYong-gang,WANGYa-ping,WANG Jian-wei,ZHENGMin,JIANGRong(Laboratory ofBiochemistry andMolecularPharmacology,College ofBasicMedicine,ChongqingUniversity ofMedicalSciences,Chongqing 400016,China) Abstract:Objective To establish the human leukemiamodel in the severe combined mmunodeficiency(SCID)mice and to investigate the pharmacological action ofGinseng polysaccharide(GPS)on leukemic cellsin vivo.Methods The human leukemiamousemodelwas established by implantingK562 cells into the caudalvein ofSCID mouse. Histochemistry,RT-CR,flowcytometry,histopathologywere used tomonitor the leukemic cells in peripheralblood,bonemarrow,liver,spleen of leukemia SCIDmousemodels,before and after injection ofGPS. Themice receiving the physiological saline instead ofGPS served as controls.Results Theperipheral blood cells did not change somuch in SCID mice in the earlierperiod of leukemia,the totalnumberofWBC slightly increased and promyelocytes of leukemia could be detected 1% -4% on day 18 afterK562cells implantation. In lastphase of leukemia,WBC significantly rose and could bemonitored 10%. After injection ofGPS,the common condition ofmousemodelswasmore improved than thatof controls,the inflammationand pathological changes of organs ameliorated.Conclusion GPS can effectively suppress leukemiain vivoand is found no obvious ill effec.t Key words:Ginseng polysaccharide;K562;severe combined immunodeficiency;animalmodel 人参多糖(Ginseng polysaccharide, GPS)是人参的主要成分之一。国内外的研究表明:GPS可诱导多种细胞因子(主要是TNF、INF-γ、IL-8等)生成而对肿瘤细胞具有杀伤作用[1, 2]。我们的研究结果也表明:GPS对人急性早幼粒细胞性白血病细胞株(HL60)增殖有明显抑制作用,其抑制作用呈时间、剂量依赖性[3]。GPS在体外能抑制K562细胞增殖并诱导其向红系和粒系方向分化[4],但人参多糖对体内白血病细胞(K562)的影响如何尚不清楚。本研究采用静脉注入K562细胞建立人白血病异种移植模型,将人参多糖注射入人白血病重症联合免疫缺陷小鼠体内,采用外周血检测、细胞周期分析、细胞形态学观察、免疫细胞化学技术、流式细胞术(FCM)、RT-PCR等检测人参多糖对模型小鼠体内K562细胞增殖抑制、诱导分化的影响。结合本课题组既往工作,系统探讨人参多糖对体内和体外K562细胞的药理作用及其机制,本研究为从祖国医学宝库中寻找出抑制白血病细胞恶性增殖的中药成分提供了理论与实验依据。1 材料与方法1. 1 材料 人参多糖(GPS)由重庆中药研究所提供(纯度98% ),以RPMI1640培养液配制成所需浓度(5 mg/ml)。RPMI1640培养基、IMDM培养基,美国GIBGO公司产品;小牛血清(BS),杭州四季清公司(批号: 990402);小鼠抗人CD13单克隆抗体, DAB试剂盒,北京中山生物技术有限公司产品; DEPC, Trizo,l Sigma公司;AMV逆转录酶,Ex taq酶为Takara公司产品;DQa、BCR-ABL引物合成由华美生物公司提供。1. 2 方法1. 2. 1 白血病小鼠模型的建立[5-7] SCID小鼠,雌性和雄性兼有, 8~10周龄,体质量23~27 g,北京联合维通利华公司提供。腹腔连续2 d注射环磷酰胺(CTX)2 mg/只,每天注射1次,第3天取对数生长期K562细胞用于移植,以尾静脉一次性注射5×106个/鼠,每次尾静脉注射的SCID小鼠数目相同。1. 2. 2 动物分组 分为两组,每组5只,对照组,白血病模型小鼠(SCID)尾静脉或腹腔注射生理盐水。GPS组,白血病模型小鼠(SCID)腹腔给予GPS,剂量为GPS 4 mg/只,连续7 d。1. 2. 3 外周血白细胞计数及分类 对照组和GPS组给药后1周及病程后期,分别取尾静脉血涂片后,经瑞氏染色,显微镜下分类计数。1. 2. 4 流式细胞术(FCM)检测CD13阳性率 取对照组小鼠、GPS组小鼠的外周血、骨髓、肝和脾细胞PBS洗涤2次,加入抗人CD13第一抗体,4℃孵育40min后PBS洗2次,沉淀加FITC标记二抗20μl混匀,4℃暗盒孵育60min,PBS洗1次,沉淀加PBS200 ml混匀后上样。FCM检测接种荧光标记的细胞。1. 2. 5 细胞周期检测 取对照组小鼠、GPS组小鼠肝、脾细胞,制成单细胞悬液,经PBS洗2次,加碘化丙烷(DAPl)和SRl01工作液,4℃避光染色30 min,流式细胞仪检测,Midfilt软件分析细胞周期分布。正常人淋巴细胞为对照。1. 2. 6 病理学检查 处死动物进行病理检查,取肾、肺以10%甲醛固定48 h,石蜡包埋切片,HE染色后进行光镜观察。1. 2. 7 免疫组织化学检测 取对照组和GPS组小鼠的肺、肝、脾,以10%甲醛固定24 h以上,石蜡切片,或者新鲜组织冰冻切片。采用共同的CD13抗体免疫组织化学反应,观察白血病细胞浸润分布情况。1. 2. 8 RT-PCR检测白血病细胞 取SCID小鼠的外周血1 ml及肝、脾、肾等组织各100 mg, Trizol法提取RNA, 28S、18S两条带清晰,D(260) /D(280) =1. 840, RNA置于-70℃待用。按反转录试剂盒说明书进行cDNA合成,用Taq聚合酶进行PCR扩增,引物序列:ABL:上游: 5′-GGTCCTGGACAGCAC-CGA-3′,下游: 5′-TGATTTCCTTCACCGAACTGA-3′; BCR上游:5′-GGTGTCGGACCGCATCAG-3′,下游: 5′-TGGCGTCGATCAG-GTTGT C-3′; DQa上游: 5′-GCATCTTTGGTTTGGGTTATG-3′,下游: 5′-ACGCAGATCATCGAAACGTC-3′。2 结果2. 1 发病情况 SCID小鼠在接种K562细胞30 d后均发生全身白血病,动物皮毛起皱、萎靡少动、步态不稳,侧偏或转圈,体质量平均为22 g,较正常组减轻7~8 g,存活时间为32~45 d。给GPS注射后,GPS组白血病小鼠精神状况明显好于对照组小鼠。体质量较对照组下降减少,平均为28 g,存活时间延长至56 d,有的小鼠甚至可以存活到70 d。2. 2 外周血象 接种K562细胞的SCID小鼠外周血象在疾病早期无明显变化,第18天白细胞数略有升高,光镜下可检测到1% ~4%人白血病细胞,病程后期,白细胞明显增高,血涂片检查人早期白血病细胞占10%。给予GPS后1周取外周血可见有核细胞数有所减少,但与对照组无统计学意义,但2周后外周血有核细胞数与对照组相比明显减少(表1)。表1 对照组SCID小鼠与GPS组外周血象(n=5,-x±s)时间白细胞(109/L)中性粒细胞(%)淋巴细胞(%) K562细胞(%)接种K562细胞后(周) 2 4.75±0.65 71±4 25±6 0 3 7.65±1.24a79±8a14±5a3.9±1a 4 9.86±1.32b82±9b6±2b10±3b注射GPS后(周) 1 10.33±1.76 80±9 6±2 13±4 2(病程后期) 7.33±1.89 77±8a13±7a 7±2aa:P<0. 05,b:P<0. 01,与对照组比较. GPS终浓度:4 mg/只×7 d2. 3 免疫细胞化学检测对照组与GPS组SCID小鼠肺、肝、脾等器官CD13表达 与对照组比较,GPS组SCID小鼠肺、肝、脾等器官CD13表达的阳性率明显降低(表2)。表2 对照组和GPS组SCID小鼠肝、脾、肺中CD13细胞表达情况[(-x±s)%]组别n脾肝肺对照组5 41±7 29±4 38±8GPS组5 21±5b16±3a20±6aa:P<0. 05,b:P<0. 01,与对照组比较. GPS终浓度:4 mg/只×7 d2. 4 细胞周期分布 对照组SCID小鼠中可见肿瘤累及肝、脾,肝、脾脏组织增生期(S+ G2+M)细胞达40. 11%、41. 66%,GPS组肝、脾脏组织增生期细胞则为31. 85%、29. 37%,与对照组相比有显著性差异(P<0. 05)。2. 5 对照组、GPS组SCID小鼠骨髓细胞CD13阳性率 流式细胞术(FCM)检测对照组SCID小鼠骨髓CD13阳性率8. 42%、GPS组SCID小鼠骨髓CD13阳性率2. 19%。2. 6 RT-PCR检测对照组和GPS组SCID小鼠中白血病累及脏器情况 RT-PCR检测SCID小鼠肝、脾、肾、骨髓、外周血未发现有白血病细胞(K562)人特有DQα基因,ABL-BCR癌基因。接种K562细胞后的对照组SCID小鼠,3~4周即可见白血病细胞累及肝、脾、肾、骨髓、外周血等主要脏器。GPS组SCID小鼠DQα仅在脾脏和外周血有表达,ABL-BCR仅在外周血有表达(图1、2)。A:对照组;B:GPS组白血病1:空白对照;2:骨髓;3:肝;4:肾;5:脾;6:外周血;7:DNA标准图1 SCID小鼠DQα的表达A:对照组;B:GPS组白血病1:空白对照;2:骨髓;3:肝;4:肾;5:脾;6:外周血;7:DNA标准图2 SCID小鼠ABL-BCR的表达2. 7 病理学检查 与对照组比较, GPS组SCID小鼠的病理症状明显减轻。肺、肾等脏器的炎症及病理变化减轻,通过HE染色检测显示脏器中浸润的肿瘤细胞明显减少(图3、4)。A:对照组 ↑:炎症细胞、尘细胞;B:GPS组图3 SCID小鼠肺的病变 (HE×400)A:对照组 ↑:肾小球可见炎症及病理变化B:GPS组,肾小球可见炎症及病理变化减轻图4 SCID小鼠肾的病变 (HE×400)3 讨论 传统的白血病治疗药物以细胞毒药物为主。细胞毒药物在杀伤恶性细胞的同时,对正常的细胞和器官也产生严重损伤。近年研究表明,白血病细胞在体外可被不同的化学物质诱导分化为正常或较正常的细胞;分化诱导剂的发现是白血病治疗药物发展的新阶段[8-10]。 人参作为传统医学的“补气”要药已有数千年的临床应用历史,人参多糖(GPS)是其主要的有效药物成分之一。近年的研究证明:人参多糖可明显增强免疫系统的功能并有免疫抗肿瘤和辅助抗肿瘤活性。另外,GPS还有降血糖以及调控血细胞生成的作用。我们既往的研究表明:人参多糖在体外具有双向调控作用,一方面可促进正常造血,另一方面又可抑制白血病细胞的增殖,诱导其向成熟方向分化;其分子机制在于调控造血生长因子的分泌、调控信号转导途径等。但人参多糖在体内的作用如何,尚少见文献报道。 由于体外研究的影响因素简单,作用的成份清楚;而体内的情况比较复杂,受多种因素的影响,在体外作用被证实有效的药物并非在体内有同样的效果。药物在体内要代谢,并受多种酶的影响,有些甚至被酶破坏,有些在体外证实无抗瘤作用的成份,在体内反而有抗瘤效果,或受到多种因素的协同或抑制作用。因此,要证实GPS的药理作用,就不能缺少体内研究的资料,而目前从药物研究角度与开发的角度都必须先进行模型建立。本研究在成功建立白血病模型后通过体内注射GPS观察其在体内对白血病的作用。本研究从以下几个方面探讨了GPS在体内对白血病动物的作用。3. 1 发病情况 给予白血病动物模型GPS(4 mg/只)后,白血病动物的精神、活动状况有所好转,体重增加,平均存活时间延长,从外部症状上可见GPS对白血病有一定的药理作用。3. 2 外周血象 白血病小鼠的外周血白细胞明显升高,在给予白血病小鼠GPS(4mg/只)后,给药后第2周即可见外周血白细胞降低,表明GPS在体内可以抑制白血病细胞的生长,这与体外GPS抑制K562的增殖是一致的。3. 3 SCID小鼠CD13阳性率的表达 CD13是检测髓性白血病细胞的重要表面标志之一,我们采用免疫细胞化学和流式细胞仪检测CD13的表达均表明GPS有一定的抑制白血病小鼠肝、脾、骨髓等组织细胞CD13的表达。3. 4 细胞周期分布 给药后的白血病模型小鼠脾脏组织细胞周期G0-G1期细胞数与对照组相比明显增加,但脾脏组织679细胞周期无显著性变化,这表明GPS能阻止白血病小鼠白血病细胞于静止期,抑制其增殖。3. 5 RT-PCR检测对照组和GPS组白血病小鼠中白血病细胞累及脏器情况 RT-PCR检测人特有DQα基因,ABL-BCR癌基因结果表明给予GPS作用后白血病细胞浸润的器官有所减少,从白血病模型白血病细胞累及到肝、脾、肾、骨髓、外周血,到给药后期的仅在外周血中发现白血病细胞。 以上实验结果表明:人参多糖能有效地治疗小鼠髓系白血病,且未发现有明显的毒副作用。提示GPS是一种潜在的治疗白血病药物,有进一步研究的价值,其体内作用机制我们需进一步深入研究。参考文献:[1] ASSINEWE V A, AMASON JT, AUBRY A,etal. 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