血管生成素-1对移植颗粒脂肪组织存活率的影响

　　作者：马乐1,张荣明2,李潇3,陈峻江2　　作者单位：江苏省苏北人民医院美容中心，江苏 扬州 225001;2.辽宁医学院附属第一医院美容整形烧伤科，辽宁 锦州 121000;

　　【摘要】 目的 本试验通过建立大鼠的脂肪移植模型，在移植体内加入血管生成素-1，利用血管生成素-1促进血管生长,加速局部血液循环重建的作用，来研究其对移植体成活率的影响。方法 健康6个月的Wistar大鼠36 只，雌性，平均体重(300±5)g。采用随机对照设计的。将所有大鼠随机分成6 组，每组6 只，1～2组为2 μg/mL浓度的Ang-1组,3～4组为0.25 μg/mL浓度的Ang-1组，5～6组为生理盐水对照组。切取大鼠双侧腹股沟处的脂肪约1 mL，纯化后按分组要求分别经2、0.25 μg/mL Ang-1和生理盐水处理后，进行自体背部皮下移植。在术后30 天取出移植的脂肪组织观察，测量脂肪体积，计算成活率。结果 3 组取出移植的脂肪组织后计算脂肪移植成活率，经高浓度Ang-1处理的移植体成活率明显高于盐水处理组的移植成活率(P<0.01)，低浓度Ang-1处理组移植体成活率也高于盐水处理组的移植成活率(P<0.01)，高、低浓度Ang-1处理组间差异无显著性意义。结论 一定浓度的Ang-1对移植鼠颗粒脂肪组织有促进其血管增生的作用，从而提高了移植后脂肪组织存活率。

　　【关键词】 血管生成素-1;脂肪移植;成活率

　　Effects of Angiopoietin-1 on Survival Rate of Transplanted Particle Fat Tissue in RatsMA Le1, ZHANG Rongming2, LI Xiao3,CHEN Junjiang2(1.Plastic Department, Subei Peoples Hospital, Yangzhou, Yangzhou 225001China;2.Plastic Department, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000 China;3.China Medical Vniversity,Shenyang 110001 China)Abstract:Objective Through establishing a rat fat-transplantation model, injecting ang-1 into fat particles, with ang-1s function of improving angiogenesis and blood-circulation, to investigate its effect on survival in recipient area. Methods Thirty-six female Wistar rats weighing 295～305 g were randomly assigned into six groups and treated as follows: both grafts in 1st and 2nd groups were mixed with 2 μg/mL ang-1，both grafts in 3 th and 4th groups were mixed with 0.25 μg/mL ang-1，both grafts in 5 th and 6th groups were with mixed normal saline as control groups. 1 mL autogenous fat grafts were excised from bilateral inguinal areas of every Wistar rats. Then it was purified and mixed with 2 μg/mL ang-1，0.25 μg/mL ang-1and 0.9% NS respectively. Finally transplanted them in the rats dorsums. Three groups transplanted tissues were taken out after 30 days, and their volumes were measured with their survival rate being calculated.Results Microvessels should brown color after CD34 staining. The values of microvessel density in ang-1groups was significantly higher as compared with that in saline groups in the same observing periods ( P<0.01). There was no significant differences between the two ang-1 groups. Conclusions A certain density ang-1 may be a candidate angiogenesis factor in fat particle auto- transplantation.

　　Key words:Angiopoietin -1; fat transplantation; survival rate

　　自体颗粒脂肪是一种获得容易、供源充足、有良好组织相容性的充填材料。但因其移植后吸收率较高，所以在临床应用中受到限制。国内外众多学者在如何能够提高移植脂肪存活率方面做了大量的实验研究，并认为加速移植体内的血管重建是提高颗粒脂肪移植存活率的关键。本试验前期已证明与对照组相比一定浓度的血管生成素-1可以增加脂肪移植体的早期血管密度，本试验将进一步来证明Ang-1是否能提高移植体的成活率。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　健康6个月的Wistar大鼠18 只，雌性，平均体重(300±5)g。采用随机对照设计的方法，将所有大鼠随机分成3 组，每组6 只，1组为2 μg/mL浓度的Ang-1组,2 组为0.25 μg/mL浓度的Ang-1组，3 组为生理盐水对照组。

　　1.2 主要试剂

　　重组人Ang-1，美国R&D公司。

　　1.3 动物处理及标本制备

　　4%的水合氯醛(1 mL/100g)腹腔内注射麻醉后，将大鼠双侧腹股沟和背部剃毛，先仰卧位，后伏卧位，碘伏消毒术区。从大鼠双侧腹股沟处切取皮下脂肪组织，为了试验准确并便于计算，我们把取出的脂肪组织用自制小量桶来精确测量约1.0 mL后，去除表面的筋膜，得到纯化的脂肪，切成4～6 mm小颗粒状备用。双侧腹股沟部彻底止血，切口缝合。在大鼠背部做约1 cm的纵行切口，分离形成2 cm×2 cm的皮下腔隙，将处理后的颗粒脂肪置入皮下腔隙内，切口缝合。再按分组要求在切口中分别注入1 mL生理盐水、1 mL 2 μg/mL的Ang-1、1mL 25 μg/mL 的Ang-1,常规饲养。

　　1.4 实验取材

　　做好记录。

　　自制小量桶：取5 mL注射器，把针端封死，在2～3刻度之间作更精确标记，可读出0.1 mL。

　　体积测量法：动物饲养30 d后,取出背部移植体,在自制量桶中装入2 mL蒸馏水，把取出的移植体放入其中，看液面升高的刻度，即为移植体的体积。

　　1.5 免疫学观察

　　测量完的脂肪组织，放入10%福尔马林中固定，常规制作石蜡切片，每块标本切片1 张，做HE染色。

　　1.6 统计学分析

　　1.5统计分析软件,3组应进行F检验及q检验。

　　2 结 果

　　2.1 实验数据整理结果。3组脂肪移植体体积值

　　2.2 统计学分析

　　对3组移植体体积值进行组间成组设计的t检验。

　　高浓度Ang-1组与盐水组相比移植体体积差异有显著意义(P <0.05。)

　　2.3 移植颗粒脂肪组织的病理学变化。

　　3 讨 论

　　有多种细胞因子通过不同的受体参与血管生成过程，如VEGF、b-FGF等。其中特异性作用于内皮细胞的细胞因子有两类：血管内皮生长因子(VEGF)及其受体系统和血管生成素- 酪氨酸蛋白激酶受体-2 (angiopoietin -tie-2) 系统。两者起不同而互补的作用。VEGF促进内皮细胞的增殖和迁移，Ang则调解内皮细胞和血管周围间质细胞的相互作用而维持血管管腔的稳定性[1]。

　　有关VEGF 及其受体在脂肪移植体血管生成中的作用已有相关报道。例如碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)，瘦素(Leptin )，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等都是通过VEGF在中间起作用的。国内廖天安[2]等人以纤维蛋白作为缓释剂，研究b-FGF对SD大鼠小颗粒状脂肪移植成活率的影响。在0.2 g移植脂肪中加入b-FGF 1 000 U、2 000 U或4 000 U，以4 000 U效果最佳。王友彬[3]等利用瘦素在血管生成中的作用,把它应用在提高脂肪移植成活率的研究中，试验表明0.6 g颗粒脂肪组织的重量维持率在移植10、20 d 后分别为108.3 %和83.3 %,与对照组相比差异有显著性意义。 Yuksel 等[4]用IGF 和FGF 进行了同样的实验，他们观察12 周的移植颗粒脂肪其重量维持率分别是87.5%、72.9%。

　　血管生成素系统是近些年来才被逐渐了解的,国外的许多研究表明Ang-1-Tie2系统在缺血性疾病中发挥着重要的作用。Ang-1可促进缺血组织中的新生血管形成。Chae [5] 通过研究Ang-1 转基因的兔子,证明其缺血的下肢组织中新生侧支血管的形成明显多于对照组。Siddiqui[6]等的实验发现,用Ang-1进行转基因治疗,原本发生缺血梗死的心肌出现明显的毛细血管的增生和灌注。Dallabrida[7]也用实验证明200 ng/mL浓度的Ang-1可以促进损伤的心肌细胞存活。从而提示Ang-1 在治疗缺血性心脏病中的运用前景。

　　Ang/Tie2在创伤修复、缺血再通等病理生理中的作用：创伤周围的扩张血管在创伤的初期就有Tie2蛋白和基因表达、磷酸化的显著增加。创伤愈合时, 侵入创口肉芽组织的新生微血管内皮强烈表达Tie2, 和肉芽组织血管化一致, Tie2 的最大表达强度在愈合第3天;愈合后期, Tie2 的表达局限于创口的边缘, 5～ 9天恢复至基础水平, 也和肉芽组织的收缩及血管消退相一致。Tie2 的这种表达方式提示其在成年组织的血管形成过程中发挥着类似胚胎形成时的促进血管组装、稳定和吸引周围细胞聚集的作用[8]。

　　本试验旨在利用Ang-1的血管活性作用，研究其对颗粒脂肪移植成活率的影响。前期试验已证明Ang-1高低两个浓度组与盐水组比较均有明显的促进血管生成作用，说明0.25 μg/mL浓度的Ang-1已可以发挥其生物学作用。移植体的早期血管重建完成的越早，就最大程度的减少了移植脂肪的液化吸收，从而使更多的脂肪得到存活。后期试验证明Ang-1高低两个浓度组与盐水组相比移植体成活率确有明显提高。与细胞因子缓释的方法不同,我们在移植时进行了颗粒脂肪组织的一次性处理, Ang-1对颗粒脂肪的作用可能只维持在混合后较短的一段时间,随着移植组织内处理液浓度因时间的延长而降低,它对颗粒脂肪的作用也会随之减弱或消失,这可能是高低浓度组在移植率上存在差别的原因。试验在一定程度上证明了Ang-1可以在自体脂肪移植中发挥作用，但因实验例数，试验大鼠可移植的脂肪数、给药次数等条件限制，实验存在一定的局限性，如果改变给药次数或给药途径，移植率能否进一步提高仍需要证明。

　　【参考文献】

　　[1] 方全，唐孝达.血管生成素与肿瘤新生血管生成[J].国外医学 生理、病理学与临床分册,2001，21(5):345-347.

　　[2] 廖天安,谢富生,王琼超,等.小颗粒脂肪移植碱性成纤维细胞生长因子及缓释剂浓度的正交筛选[J].中华整形烧伤外科杂志，1998，14(4):283-285.

　　[3] 王友彬，戚可名，赵敏，等.瘦素促进移植颗粒脂肪成活的实验研究[J].中华整形外科杂志，2004，20(5)：366-368.

　　[4] Yuksel E，Weinfeld AB，Cleek R,et al, Increased free fat –graft survival with the long term local delivery of insulin, insulin-like growth factor-1,and basic fibroblast growth factor by PLGA/PEG microspheres[J]. Plast Reconstr Surg,2000,105(5):1712-17201 .

　　[5] Chae JK,Kim I,Lim ST,et al. Coadministration of angiopoietin21 and vascular endothelial growth factor enhances collateral vascularization [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(15):2573-2578.

　　[6] Siddiqui AJ,Blomberg P,Wardell E,et al. Combination of angiopoietin21 and vascular endothelial growth factor gene therapy enhances arteriogenesis in the ischemic myocardium[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,310(3) : 1002-1009.

　　[7] Dallabrida SM, Ismail N, Oberle JR, et al. Angiopoietin-1 promotes cardiac and skeletal myocyte survival through integrins[J]. Circ Res，2005,96(4):8-24.

　　[8] Wong AL,Haroon ZA,Wemer S, et al. Tie-2 expression and phosphorylation in angiogenesis and quiescent adulttissues[J].Cire Res,1997, 81: 567- 574.