病理性瘢痕基因治疗的研究现状通

　　作者：黄智龙,徐斌,蔡景龙　　作者单位：1.苍山县人民医院外一科，山东苍山277700;2.江苏大学附属人民医院，江苏镇江212002;3.中国协和医科大学整形外科医院十六科，北京

　　【关键词】 增生性瘢痕;瘢痕疙瘩;基因治疗;细胞因子

　　病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前国内外的研究尚未能很好地揭示其发病机制，临床防治也存在较大困难，成为了医学研究的难点和重点问题之一。近年来，随着基因工程技术的研究进展，病理性瘢痕的基因治疗成为研究的热点，现就其研究现状综述如下。

　　1 细胞因子基因疗法

　　目前的研究表明，各种细胞因子对创面愈合和瘢痕防治的作用不同，通过基因转染、基因敲除等手段，针对这些细胞因子的作用进行干预，可以达到防治瘢痕的目的。

　　1.1 转化生长因子β(TGF-β) TGF-β在瘢痕形成及发展中起着非常重要的作用[1]。Choi等[2]以反义TGF-β1核酸转染动物伤口，结果发现在给予反义寡核苷酸转染抑制TGF-β功能后，伤口瘢痕形成显著减少。liu等[3]用含有截短型TGF-β Ⅱ型(tTGF-βR Ⅱ)受体的腺病毒转染新生大鼠背部线性伤口，检测结果表明腺病毒介导的tTGF-βR Ⅱ可促进创伤愈合，减少瘢痕形成。

　　Ashcroft等[4]证实Smad3 缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成减少。Gao等[5]证实针对Smad 2的小干扰RNA转染能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的I、Ⅲ型胶原分泌。提示通过对TGF-β下游分子Smad进行干预，也能对抗TGF-β促瘢痕形成作用。

　　1.2 肝细胞生长因子(HGF) HGF可抑制肝纤维化组织中TGF-β1的产生，增强胶原酶的活性。Ha 等[6]以腺病毒载体将人的HGF转染兔耳增生性瘢痕，结果显示实验组瘢痕明显缩小，胶原成分也较对照组减少，而且有更多的毛囊和汗腺结构出现。

　　1.3 结缔组织生长因子(CTGF) CTGF在肝、肾、等器官纤维化中具有重要作用，是TGF-β的下游分子，能促进成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达[7]。

　　刘剑毅等[8]以脂质体将CTGF反义寡核苷酸导入瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)，证实CTGF反义寡核苷酸能抑制细胞增殖，减少其胶原合成。然而目前针对CTGF进行的瘢痕基因治疗尚缺乏体内实验研究。

　　1.4 肿瘤坏死因子α(TNF-α) TNF-α来源极为广泛，包括各种免疫细胞、成纤维细胞等，TNF受体表达于除红细胞外的所有体细胞和多种肿瘤细胞表面，TNF-α与其结合后参与炎性反应、免疫应答和抗肿瘤作用等。何威等[9]研究表明TNF-α对瘢痕疙瘩治疗有效。Messadi等[10]通过实验证明，瘢痕疙瘩使用TNF-α治疗后，其成纤维细胞的NF-kappa B表达活性持续升高，诱导了成纤维细胞的凋亡。

　　1.5 致炎细胞因子 Xue 等[11]的研究证明，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的成纤维细胞中白介素-6(interleukin 6, IL-6)含量比正常皮肤高，Ghazizadeh等[12]发现KFs的IL-6及其受体IL-6Rα和IL-6Rβ表达比正常皮肤成纤维细胞平均高6倍以上，用IL-6刺激正常皮肤成纤维细胞后，其胶原分泌增加，而以IL-6或IL-6Rα中和抗体处理KFs后，细胞胶原分泌明显减少。

　　1.6 γ-干扰素(IFN-γ) IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生，能以与细胞外基质相连的形式存在，通过旁邻方式控制细胞生长[13]。近年来其被临床用于病理性瘢痕的治疗，能抑制病理性瘢痕中瘢痕成纤维细胞增殖，下调Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达，并促进胶原酶的产生，可拮抗TGF-β的作用，是创伤修复与瘢痕形成过程中的一种比较明确的负性调节因子。Harrop等[14]等研究证实，IFN-γ 可以诱导成纤维细胞凋亡，使肉芽组织和其后的瘢痕组织中成纤维细胞数量减少而逐渐成熟。人们将IFN-γ直接注入到增生性瘢痕中，可以明显减小瘢痕的体积。Granstein等[15]对8例瘢痕疙瘩患者采用双盲试验，结果表明用IFN-γ治疗的瘢痕疙瘩高度平均减少30.4%，病理示表皮及真皮明显变薄;而安慰剂组瘢痕高度几乎未减少。Larrabee等[16]也用IFN-γ瘢痕内注射治疗瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕，结果发现10例中有5例瘢痕直径减少了一半。

　　2 细胞凋亡基因调控

　　病理性瘢痕的形成过程中,成纤维细胞增殖凋亡调控失常及基质分泌增多是其产生的根本原因，在瘢痕成熟过程中成纤维细胞数量的减少主要是由细胞凋亡引起的，病理性瘢痕中存在着细胞增殖和凋亡的异常，因此有研究者通过对凋亡相关基因的干预进行了瘢痕基因治疗的研究。

　　2.1 p53 p53基因编码一核蛋白，是最著名的抑癌基因。它结合和调节DNA修复、细胞分裂和细胞凋亡的基因表达[17]。Ladin等[18]通过对瘢痕疙瘩组织标本中的主要凋亡相关蛋白表达进行免疫过氧化酶分析，发现18/20例中有p53表达,主要以核周方式分布于瘢痕疙瘩边缘部的增生部位，认为p53调节异常可引起瘢痕疙瘩边缘部增生区细胞增生和凋亡减少。王春梅等[19]对p53基因的外显子4进行限制片段长度多态分析发现,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织及体外培养KFs中均存在p53基因突变，p53基因突变可以使细胞处于一种增殖状态，从而导致瘢痕疙瘩的形成。刘旺等[20]采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析方法和基因测序法，检测各种组织成纤维细胞中p53基因的突变情况，发现瘢痕疙瘩中有9/12例p53基因外显子4、5、6、7出现点突变和移码突变,认为p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。于冬梅等[21]在研究中发现，瘢痕疙瘩与增生性瘢痕中p53的mRNA高表达。肖志波等[22]将携带野生型p53基因的腺病毒转染体外培养的KFs，发现瘢痕疙瘩的成纤维细胞的增殖被明显抑制。

　　2.2 Fas(CD95)和FasL Fas(CD95)和FasL是已认识到的一对诱导细胞凋亡的重要膜蛋白因子，它们之间构成一条独特的细胞凋亡通路，参与了多种疾病的病理生理过程。陈伟等[23]通过实验观察到Fas和FasL在增生性瘢痕的表皮基底层细胞内有少量分布，阳性细胞率显著降低，提示增生性瘢痕的发生可能与Fas、FasL和Caspase-3蛋白表达降低、由这三种蛋白介导的细胞凋亡受阻相关。鲁峰等[24]成功地构建了携带Fas基因的重组腺病毒，感染后KFs能稳定表达有功能的Fas蛋白，利用重组腺病毒转染可以重建被阻断的KFs Fas死亡信号传导通路。

　　3 自杀基因治疗

　　自杀基因又称为前药转换酶基因,将一些病毒或细菌基因组中的前药转换酶基因导入肿瘤细胞,这种基因可以编码特殊的酶,将原先无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物,从而达到杀死肿瘤细胞的目的。自杀基因治疗恶性肿瘤是利用转基因方法将哺乳动物不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内，其表达产物可将无毒性的药物前体转化为细胞毒药物，影响细胞的DNA合成，从而引起细胞死亡[25]。由于多采用病毒作为载体，故称为病毒介导的酶解药物前体疗法。

　　自杀基因在肿瘤治疗方面的研究已有多年的历史，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) 基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK) 基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶( EC-CD) 基因、大肠杆菌脱氧胸苷激酶(DCK) 基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(GPT) 基因及细胞色素p450 基因。其中研究最深入、应用最广泛的自杀基因系统首推胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase ，TK)基因/丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因/5-氟胞嘧啶( 5-fluorocytosine, 5-Fc)。

　　3.1 TK基因 TK基因编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物(NA)代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物，阻止DNA复制，导致细胞死亡，而发挥抗肿瘤作用。HSV-TK/GCV系统不仅能杀灭表达TK阳性细胞，而且通过旁观者效应可以引起相邻TK阴性细胞死亡，提高了基因治疗的效率。肖生祥等[26]将HSV-TK/GCV系统应用于体外培养的成纤维细胞时，观察到了其细胞毒性作用。柯正等[27]以携带胸苷激酶基因的逆转录病毒转染体外培养的KFs的同时应用前体药物无环鸟苷，显示了自杀基因疗法对KFs的杀伤作用。

　　3.2 CD基因 CD基因存在于一些细菌和真菌基因组中，哺乳动物细胞无此基因。目前研究最多的是大肠杆菌CD基因。CD基因编码胞嘧啶脱氨酶，编码的胞嘧啶脱氨酶可将胞嘧啶代谢为尿嘧啶，抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而影响DNA的合成。另外，5-Fu在体内转化为5-氟尿嘧啶核苷(5-FUR)后，也能掺入RNA 中干扰蛋白质合成，对其他各期细胞也有作用。5-Fu作为一线化疗药物，用于消化道肿瘤、乳腺癌及妇科肿瘤等的化疗，效果良好，整形外科也将其用于瘢痕的非手术治疗方法之一[28]。Kontochristopoulos等[29]对20例瘢痕疙瘩患者用5-Fu治疗1周(局部注射，浓度50 mg/ml)，随访12个月，超过85%的患者有明显效果。CD/5-Fc系统基因治疗重要特点在于其旁观者效应，其作用特点和机制类似于TK基因。

　　3.3 CD-TK双自杀基因 单自杀基因疗法用于肿瘤治疗有很多优点，但它也存在许多不足之处,如各类自杀基因系统治疗肿瘤都存在一定程度的局限性，自杀基因治疗肿瘤可能存在对肿瘤细胞类型的依赖性，因此不少学者探讨双自杀基因的应用研究。目前探究的双自杀基因多为CD-TK基因，其产物同时具有两种酶的活性，即CD和TK两者的活性，可以产生互补的作用，大大提高其应用价值。研究表明，CD-TK双自杀基因不需考虑自杀基因的肿瘤细胞类型依赖性，可以最大限度地消除肿瘤细胞对治疗药物的耐药性，和放疗合用，可大大增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，比单自杀基因疗法具有更大的优越性。宋悦等[30]在体外实验中发现CD-TK融合基因对卵巢癌细胞有良好杀伤作用。黄宗海等[31]亦通过实验观察到VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用。苏国强等[32]发现KDR基因启动子调控的CD-TK融合基因体系可选择性杀伤乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮细胞。徐斌等[33-35]联合应用胸苷激酶基因和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因转染KFs，发现在应用前体药物后，KFs发生了明显的凋亡，对瘢痕疙瘩具有强大的杀伤效应和旁观者效应，显示了良好的应用前景。

　　4 展 望

　　病理性瘢痕的基因治疗为攻克瘢痕难题展现了良好的前景，但目前多停留在实验室研究阶段，因其生物安全性问题，致使瘢痕基因治疗至今未能进入临床治疗实验。如目前所应用的载体特别是病毒类载体，尚存在导致机体免疫反应、基因突变以及野生病毒毒力恢复等问题。加上创伤愈合和瘢痕形成是多因素参与的过程，单一因子的导入很难实现理想的治疗效果;在瘢痕形成过程中，某一因子可能在某一特定阶段过表达或下调才能发挥其抑制瘢痕形成的作用，而时间错位的过表达或下调反而可能产生不利影响，使病理性瘢痕的研究和治疗具有很大的复杂性和挑战性，因此值得人们做进一步深入细致的研究，相信不久的将来人们会取得病理性瘢痕研究的更大成就。

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