体外血管生成三维培养模型的构建

　　作者：林菊丽， 王彪， 黄祖根， 吴正思， 鲁开化， 庄福连 作者单位：1.福建医科大学 附属第一医院整形外科，福州 350005;2.第四军医大学 西京医院整形外科中心，西安 710043

　　【摘要】 目的 建立脐静脉内皮细胞(HUVECs)的体外血管生成的三维培养模型。 方法 以酶消化法获得以HUVECs为主的混合细胞悬液，经反复贴壁法分离纯化HUVECs，通过免疫细胞化学染色鉴定。采用夹心培养法构建HUVECs的体外血管生成三维培养模型。 结果 HUVECs在胶原凝胶之间，24 h左右血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构，2 d后凝胶内的细胞开始退化，3 d发现大部分细胞出现崩解。24 h凝胶经HE染色可见细胞索及原始血管腔形成。 结论 成功建立体外血管生成的三维培养模型。夹心培养法是较为成熟的体外血管生成的三维培养方法，具有操作简便、三维血管样结构形成数量多、网络结构复杂等特点。

　　【关键词】 内皮，血管; 内皮细胞; 细胞，培养的; 细胞培养技术; 脐静脉; 新生血管化，病理性

　　血管生成即由原有血管出芽生长形成新生血管的过程，血管生成参与多种生理和病理过程，如发育、再生、炎症和肿瘤的生长与转移等[12]。肿瘤血管生成已成为当前肿瘤研究的热点，通过抑制肿瘤血管生成进行抗肿瘤治疗，被认为是非细胞毒性治疗肿瘤中最具前途的方法之一[34]。

　　内皮细胞的三维培养法是利用血管内皮细胞在三维条件下形成血管状结构的特点，模拟体内的血管形成过程，是揭示体内血管形成的最佳体外模型。本研究利用分离纯化的脐静脉内皮细胞(HUVECs)、选用夹心培养法构建体外血管生成的三维培养模型，目的在于获得体外三维血管样结构，以便进一步在体外研究血管生成的抑制实验。这对评估各种影响因素对血管生成的影响具有实际应用价值[5]，并为今后针对肿瘤性血管生成的肿瘤治疗方法提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要器材及试剂 超净工作台(BCM1000，苏州苏净集团);体积分数为0.05的CO2恒温培养箱(美国REVCO公司);倒置显微镜(Olympus CK40，日本)、台式冷冻高速离心机(HERMLE ABORTECHNIK Z323K，德国);数显鼓风干燥箱(MBE GZX907，上海博迅公司);胎牛血清及M199培养液(美国Hyclone产品)、鼠尾胶、Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶、胰酶(1∶250)消化液(美国Sigma公司)、血管内皮生长因子(VEGF;美国Peptrotech公司)，鼠抗人单克隆CD31抗体、CD34抗体、第Ⅷ因子抗体(美国Santa Cruz公司)，UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒(福州迈新公司)。

　　1.1.2 对象 取福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖腹产后的新鲜胎儿脐带组织，长约20 cm，置于含100 μ/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的4 ℃ PBS缓冲液中分离纯化。

　　1.2 方法

　　1.2.1 HUVECs的分离纯化并鉴定

　　1.2.1.1 酶消化法获取HUVECs混悬液 参照文献[6]方法。在无菌条件下，将新鲜的胎儿脐带脐静脉一端置入已磨平的16号针头，止血钳固定，注入PBS缓冲液反复冲洗至无血迹。止血钳夹住静脉另一端，以20 mL的注射器向脐静脉内徐徐注入0.1%胶原酶溶液，至血管充盈。立即将脐带放入37 ℃培养箱内，15～25 min后取出。松开止血钳，通过注射器向脐静脉内灌注PBS液，收集流出液置离心管内，1 000 r/min离心10 min。弃上清，以M199完全培养液重新悬浮细胞，并接种于预先以明胶覆盖的100 mL的玻璃培养瓶内。

　　1.2.1.2 反复贴壁法纯化HUVECs 将接种HUVECs混悬液的培养瓶于培养箱内静置20 min。倒置显微镜下观察见部分细胞贴壁，稍加摇荡不浮起，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起倒入或吸到另一培养瓶中。重复上述操作2～3次后，将HUVECs和成纤维细胞分离开，所得的细胞混悬液为HUVECs与血液系统细胞的混合液。将混合液静置培养，24 h后换液，使用PBS漂洗贴壁生长的HUVECs，洗脱悬浮生长的血液系统细胞，得到纯化的HUVECs，可见到贴壁生长的HUVECs，以后隔天换液，待长满后1∶2～3传代培养。 A:4 h左右开始贴壁, 形成单层多细胞集落，细胞呈梭形(×100);B:接种培养5 d后细胞融合生长，并铺满培养瓶底，呈铺路石状(×100);C: HUVECs呈圆形，胞核及核仁清晰可见(×400)

　　1.2.1.3 HUVECs的鉴定 应用免疫细胞化学染色法检测CD31、CD34、第Ⅷ因子的表达，使用SP染色法，操作按试剂盒说明书进行。用已知标准片作为阳性对照，同时用PBS替代第一抗体做阴性对照。

　　1.2.2 体外血管生成的三维培养模型的构建 参照文献[7]方法加于改良。取7份鼠尾胶溶液、1份10×M199培养液、1份胎牛血清和1份0.2 mol/L HEPES溶液及终浓度40 ng/mL的VEGF，在冰浴下迅速混合成胶原工作液。于12孔细胞培养板每孔加入500 μL，置细胞培养板于体积分数为0.05的CO2孵箱约2～3 h，直到胶原工作液形成凝胶。取指数生长期细胞用培养液调整细胞浓度成1×106 mL-1细胞悬液。每孔加入1 mL细胞悬液，置体积分数为0.05的CO2孵箱中约1～2 h，直到细胞在胶原凝胶上贴附。吸尽孔内培养液，再加入500 μL胶原工作液，置体积分数为0.05的CO2孵箱2～3 h，至上层胶原形成凝胶。之后每孔加入1 mL M199完全培养液，持续培养，倒置显微镜下观察内皮细胞生长情况。培养24 h后，取部分孔板将凝胶进行4%中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋、水平连续切片、HE染色等处理，显微镜下观察内皮细胞在凝胶中的生长情况。可据实验要求于12孔培养板重复配制数孔，便于分组比较。

　　2 结 果

　　2.1 原代培养的HUVECs形态 原代培养的HUVECs在4 h左右开始贴壁，形成单层多细胞集落，细胞呈梭形;伴随细胞迅速生长，集落增大初长出的细胞为梭形，一般5 d左右融合成片，细胞互不重叠，呈单层铺路石状镶嵌排列，此时细胞呈多角形、梭形或卵圆形;HE染色时，密集区细胞核呈椭圆形，淡蓝色，密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞核呈梭形，着色深，呈紫蓝色(图1)。

　　2.2 HUVECs免疫化学染色鉴定 分离纯化获得的HUVECs，经CD31、CD34、第Ⅷ因子染色显示，在细胞的细胞质有棕黄色颗粒沉着，三者在内皮细胞均为阳性表达(图2)。

　　2.3 体外血管生成的三维培养模型的构建情况 倒置相差显微镜下可见HUVECs在胶原凝胶之间起初呈单个排列，细胞圆形或卵圆形，随着培养时间延长细胞形态逐渐发生改变，伸长成梭形、形成突起，相邻细胞突起相互连接，逐渐从凝胶表面向凝胶内迁移，出现少量的由细胞迁移连接形成的血管样结构，12 h后血管样结构数量增多，并且相互之间出现连接沟通，随着时间推移，血管样结构越趋复杂，24 h左右血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构，2 d后凝胶内的细胞开始退化，3 d发现大部分细胞出现崩解。HUVECs在体外三维培养24 h，凝胶水平连续切片后行HE染色，可见到由内皮细胞索形成的管网状结构(图3)。 A:12 h后,相邻细胞突起相互连接,逐渐从凝胶表面向凝胶内迁移,细胞迁移连接形成血管样结构,并且相互之间出现连接沟通; B:24 h,血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构; C:>2 d,凝胶内的细胞开始退化; D:>3 d,大部分细胞出现崩解; E:培养24 h,凝胶水平连续切片后行HE染色,可见到由内皮细胞索形成的管网状结构.

　　3 讨 论

　　血管内皮细胞的分离和培养在认识正常的血管新生和肿瘤血管生成及血管病理生理等过程中发挥了关键作用。内皮细胞的体外三维培养模型是模拟及揭示体内血管形成过程的最佳体外模型。

　　血管内皮细胞是位于循环血液与血管壁内皮下组织之间的单层细胞，具有多种重要的生理功能。本实验采用的是人HUVECs，它是体外研究血管内皮细胞的重要来源，除具有来源充足、获取方便、能获得较多细胞等优点外，与来源于动物的内皮细胞相比，实验条件和结果更符合人体情况。1980年，Folkman等首次观察到内皮细胞在体外培养体系中具有形成血管样结构的趋势，由此揭开了内皮细胞体外三维培养的序幕[8]。Martins等证实在三维培养体系与二维培养体系中内皮细胞的生物学行为存在着显著差异，三维培养体系中内皮细胞的生长更类似于体内血管生成[9]。近20余年来，内皮细胞的体外三维培养技术日臻成熟。体外三维培养技术主要包括表面培养法、夹心培养法、混合培养法、微载体培养法以及基质内细胞聚集体侵袭法等，这些方法目的相同、价值相似，但选用何种方法在不同的基质及条件中有不同的选择。本实验所采用的是被广大学者所采用的夹心培养法,它操作简单方便，较适合常规倒置显微镜连续观察内皮细胞形态改变及迁移、血管样结构形成的过程，并可借助计算机辅助技术进行血管样结构的数目及长度的计数。它为离体细胞的生长更好的提供三维空间, 是在体血管生成最简单的模型。

　　本研究所采用的细胞外基质Ⅰ型胶原是一种比较常用的细胞外基质，它可以增强细胞的贴附性，凝固后形成具有一定的展性的凝胶，用“三明治法”在其夹心中接种细胞，可见细胞的移行和向胶原内浸润，并形成管腔样结构。这与Ingber等所阐述的理论相符，即内皮细胞包埋在有展性的胶原中可以分化，形成静态管型;而在硬度较大的胶原中只增殖，形成单层细胞[10]。本实验显示，细胞接种12 h后相邻的细胞伸展、延长进而相连形成血管样结构，24 h可见到血管样结构互相连接形成网络样结构，但2 d后凝胶内的细胞开始退化，3 d后发现大部分细胞出现崩解，这可能由于凝胶内的促血管生长因子如VRGF的逐渐耗竭以及其他因素的变化有关。如何延长三维培养模型中形成的复杂血管样结构的时间，对于利用其作为体外血管生成机制和抗血管生成的研究可能具有更重要的意义，笔者已在做进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Fonsatti E,Altomonte M,Nicotra M R,et al. Endoglin (CD105): a powerful therapeutictarget on tumorassociated angiogenic blood vessels[J]. Oncogene, 2003,22:65576563.

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　　[3] Guerrero Esteo M,Sanchez Elsner T,Letamendia A,et al. Extracellular and cytoplasmic domains of endoglin interact with the transforming growth factorbetareceptors I and Ⅱ[J]. J Biol Chem, 2002,277(32):29，19729，209.

　　[4] Takahashi N,Kawanishi Tabata R,Haba A,et al. Association of serum endoglin with metastasis in patients with colorectal, breast, and other solid tumors, and suppressive effect of chemotherapy on the serum endoglin[J]. Clin Cancer Res, 2001,7(3):524532.

　　[5] Vailhe B,Vittet D,Feige J J. In vitro models of vasculogenesis and angiogenesis[J]. Lab Invest, 2001,81(4):439452.

　　[6] Jeffe E A,Nachman R L,Becher C G,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilicaleins. Identification by morphologic and immunologic criteria[J]. Clin Invest, 1973,52:27452756.

　　[7] Pepper M S,Ferrara N,Orci L,et al.Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis invitro[J]. Bio and Biophy Res Com，1992,189(2):824.

　　[8] Folkman J,Haudenschild C. Angiogenesis in vitro[J]. Nature, 1980,288(5791):551556.

　　[9] Martins G G,Kolega J. Endothelial cell protrusion and migration inthreedimensional collagen matrices[J]. Cell Motil Cytoskeleton, 2006,63(2):101115.

　　[10] Ingber E D,Folkman J. How does extracellular matrix control capillary morphogenesis[J]. Cell, 1998,53:803805.