严重烧伤大鼠离体肺泡巨噬细胞CD14表达调控的实验研究

　　作者：李友良， 郇京宁， 陈玉林， 夏照帆， 王光毅， 郭云， 贾 氢 作者单位：1.兰州军区 乌鲁木齐总医院光子美容整形中心，乌鲁木齐 830000;2.第二军医大学 长海医院烧伤中心，上海 200433;3.兰州军区 乌鲁木齐总医院感染控制科，乌鲁木齐 830000

　　【摘要】目的 探讨严重烧伤对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(CD14)和 mRNA基因表达变化的影响，以及抗CD14抗体对AM产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL6)的调控作用。 方法 (1)成年SD大鼠84只，分为烧伤组和内毒素(LPS)组(每组42只)，每组均分为1，2，4，6，8，10和12 h共7个时相点，并设对应的对照组(各6只大鼠)。大鼠烧伤和LPS注射后检测外周血LPS浓度。(2)成年SD大鼠168只，分为烧伤血清组、血清抗体组、LPS组、LPS抗体组(每组42只)，每组均分为1，2，4，6，8，10和12 h共7个时相点，并设对应的对照组(各6只大鼠);各组大鼠行全肺在体支气管肺泡灌洗分离AM，并按时相点分别进行体外培养。以上4组分别加入烧伤血清、烧伤血清+抗体、LPS、LPS+抗体，在以上相同时相点终止培养，RTPCR、免疫组织化学及ELISA方法分别检测4组AM在各时相点CD14 mRNA表达、蛋白表达及分泌TNFα和IL6的变化。 结果 (1)烧伤组与烧伤对照组、LPS组与LPS对照组比较发现，烧伤及LPS注射后大鼠各时相点外周血LPS浓度均明显高于对照组。(2)烧伤血清组、LPS组与对应的对照组比较发现，烧伤血清组、LPS组大鼠AM各时相点CD14 mRNA表达、蛋白表达均明显增高，AM培养上清中TNFα和IL6浓度亦相应显著增高(P<0.01)。以烧伤血清与AM培养1 h后，烧伤血清组培养上清中TNFα和IL6浓度即显著增加。与烧伤血清组比较，血清抗体组AM在各时相点CD14 mRNA表达、蛋白表达显著降低(P<0.01)，TNFα和IL6浓度亦显著降低(P<0.01)。与LPS组比较，LPS抗体组AM在各时相点CD14 mRNA表达、蛋白表达显著降低(P<0.01)，TNFα和IL6浓度亦显著降低(P<0.01)。 结论 严重烧伤后外周血LPS浓度增加，离体AM CD14 mRNA表达和蛋白表达均显著增加，使LPS对免疫系统的激活作用显著增大;AM分泌TNFα和IL6明显增加，而抗CD14抗体可以明显拮抗AM合成和分泌炎性介质。提示严重烧伤后通过调节CD14的作用而减少炎性介质的合成和分泌是可行的。

　　【关键词】 巨噬细胞 肺泡 白细胞介素6 肿瘤坏死因子α 抗原 CD14 烧伤 大鼠 Wistar 疾病模型 动物

　　严重烧伤后大量肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL6)等前炎性细胞因子释放，导致全身炎症反应综合征(SIRS)的发生。单核巨噬细胞在此过程中起关键作用，它不仅是大量细胞因子的来源，也可能是后续炎症反应放大的启动因素，但其中的机制尚有较多不明之处。本实验通过观察内毒素(LPS)受体CD14在烧伤大鼠肺泡巨噬细胞(AM)产生TNFα和IL6中的作用及CD14抗体的阻断作用，探讨LPS信号传导通路对SIRS产生的影响，以及烧伤后抑制细胞因子过量分泌的可能途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 烧伤模型及烧伤血清制备 成年SD大鼠84只，体质量200 g左右[第二军医大学训练部实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK(军)2000012]，随机分为烧伤组和对照组(假烫组)，再于1，2，4，6，8,10和12 h各时相点分为7组，每组大鼠6只。气管穿刺注入植物血凝素0.4 mL(100 mg/mL)，3 d后进行实验。烧伤组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，背部去毛，恒温水烫仪(第二军医大学烧伤科实验室研制)100 ℃烫10 s，制成20% Ⅲ度烧伤模型(经病理证实);对照组大鼠以37 ℃水模拟烫伤过程。分别于伤后1,2,4,6,8,10,12 h处死动物，分离AM和外周血血清，每只动物取血清0.5 mL进行LPS检测，其余血清置于-70 ℃冰箱备用。

　　1.2 LPS检测 取上述分离血清，依合成基质偶氮显色法试剂盒(批号960702，上海医学化验所)主要步骤进行，反应终产物在波长545 nm处比色测吸光度，依所测吸光度(D)值在标准曲线上换算成LPS含量，每次检测标本分别绘制标准曲线。

　　1.3 AM的提取培养 大鼠处死后立即开胸，用PBS缓冲液行全肺在体支气管肺泡灌洗(BAL)，灌洗液以860 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清，加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为106 mL-1，接种于24孔板，每孔2 mL，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2温箱孵育1 h，PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞主要为AM。取部分细胞样品做细胞过氧化物酶纯度和台盼蓝拒染活力鉴定，纯度和活力均>95%。将上述部分细胞用于mRNA含量测定，部分进行CD14蛋白含量和分泌TNFα和IL6含量测定。

　　1.4 AM CD14蛋白含量和分泌TNFα、IL6浓度测定 细胞培养1 h，提取培养上清，然后将细胞用丙酮固定10 min、60 ℃烘箱烘干后，置于-70 ℃冰箱保存待测定。将培养上清采用ELISA方法进行TNFα和IL6浓度测定(ELISA试剂盒由美国R & D system公司提供);用ABC免疫组织化学法(试剂盒由上海华美生物技术公司提供)测定细胞膜表面CD14含量变化，检测阳性强度相对值和阳性面积比值，以均值表示，阳性细胞呈棕黄色。

　　1.5 CD14 mRNA表达含量的测定 总RNA的提取采用TRIzol Reagent总RNA抽提试剂盒，操作步骤按试剂盒操作指南进行。每标本取2 μL总RNA，根据Access RTPCR试剂盒(美国Promega 公司)实验步骤进行RTPCR反应。取固定量的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶扫描成像分析仪处理系统进行光密度扫描，求出电泳条带的平均光密度与面积，用平均光密度与面积的乘积代表PCR扩增产物的相对含量，测定并比较严重烧伤后大鼠AM 各时相点CD14 mRNA表达的变化。大鼠CD14引物和βactin按以下序列合成：

　　CD14引物(373 bp)：

　　F：5’TGA GTA TTG CCC AAG CAC ACT3’

　　R：5’GTA ACT GAG ATC CAG CAC GCT3’

　　βactin(764 bp)：

　　F：5’ TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3’

　　R：5’GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3’

　　1.6 烫伤血清及CD14抗体对培养上清中TNFα和IL6浓度的影响 按前述方法提取并培养AM，取18孔细胞，将收集的AM分为4组：烧伤血清组加30%烧伤血清、血清抗体组加30%烧伤血清和抗体、LPS组加LPS、LPS抗体组加LPS和抗体，抗体组烫伤血清中含有CD14 多克隆抗体(SC6999,美国Santa Cruz Biotechnology公司提供)。每组按刺激后1，2，4，6，8，10,12 h分7个时相点，每时相点检测5份细胞标本。对照组加假烫血清，其余处理相同。细胞培养24 h后，更换培养液。于培养1 h后取上清，ELISA方法测定TNFα和IL6浓度，上清中细胞因子浓度均为减去了培养0时相点的细胞因子浓度，即为各时相点细胞因子浓度的增加值。

　　1.7 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0软件包进行统计学处理。采用t检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 烧伤后外周血LPS浓度变化 烧伤组和LPS组与各自对照组比较发现，烧伤及LPS注射后外周血中LPS浓度立即开始缓慢上升，至8 h达高峰后开始下降，烧伤组和LPS组各时相点LPS浓度均明显高于对应对照组(表1)。表1 严重烧伤后大鼠外周血内毒素浓度变化

　　2.2 体外培养大鼠AM 膜CD14蛋白表达水平变化 烧伤血清组和LPS组与各自对照组比较发现，烧伤血清和LPS刺激后，烧伤血清组和LPS组AM 膜CD14蛋白表达水平在各时相点均明显增加，阳性强度均值分别为(9.91±1.30)和(8.23±1.52)，阳性细胞比例分别为(48.57±5.35)%和(46.44±5.12)%。抗CD14抗体作用后，以上指标均显著下降，阳性强度均值分别为(3.33±0.43)和(3.03±0.43)，阳性细胞比例分别为(22.00±2.34)%和(21.96±2.19)%。烧伤血清组与血清抗体组、LPS组与LPS抗体组比较，差别有统计学意义(P<0.01，表2)。

　　2.3 体外培养大鼠AM CD14 mRNA表达水平变化 烧伤血清组和LPS组与各自对照组比较发现，烧伤血清和LPS刺激后AM CD14 mRNA的表达在各时相点均明显增加(P<0.01)，阳性强度分别为(1.90±0.31)和(1.24±0.17)，2 h达峰值后缓慢下降，但12 h内仍持续在较高水平。抗CD14抗体作用后，烧伤血清组和LPS组CD14 mRNA表达在各时相点均明显降低，阳性强度平均分别为(0.25±0.02)和(0.27±0.04)。烧伤血清组和LPS组比较差别无统计学意义(表3，图1)。

　　2.4 烧伤血清及CD14抗体对AM培养上清中TNFα和IL6浓度的影响 培养1 h后，烧伤对照组大鼠AM培养上清中TNFα浓度增加值为(0.57±0.11)，烧伤血清组TNFα浓度增加值明显增高(5.89±0.91)(P<0.01)，而烧伤血清+抗体组TNFα浓度增加值(0.98±0.71)明显小于烧伤组(P<0.01)。IL6浓度变化亦有相同规律(表4)。表2 严重烧伤后大鼠肺泡巨噬细胞膜CD14表达变化表3 严重烧伤后大鼠肺泡巨噬细胞 CD14 mRNA相对含量变化

　　3 讨 论

　　严重烧伤后，免疫系统被激活和大量炎症介质释放导致SIRS的发生，单核巨噬细胞在其中起关键作用[1]。肺组织是烧伤后全身炎症反应较易波及的一个靶器官，其局部的过度炎症反应即急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，而肺组织中的AM被认为是诱发肺组织局部ARDS乃至全身炎症反应的重要效表4 严重烧伤后大鼠肺泡巨噬细胞分泌TNFα和IL6的变化

　　应细胞。在肺内，TNFα、IL6主要来源于AM[2]。LPS已经被认为是SIRS发生的始动因素。以往研究发现，受烧伤和LPS影响，离体AM CD14的基因和蛋白表达增加，刺激细胞因子大量释放[34]，本研究的结果亦证实了这一点。巨噬细胞膜表面的CD14是LPS的受体，在单核细胞激活及炎症反应过程中起关键性的作用[5]。LPS 是免疫系统的有效活化剂，主要经过单核细胞及AM介导，释放一系列炎症趋化因子及TNFα、IL8、IL1β、IL6 等细胞因子，引起肺部炎症反应[3]。实验证实LPS 刺激AM产生TNFα、IL6，不产生抑制性因子IL10[6]，而烧伤后LPS如何诱发机体产生过度免疫反应，其机制尚不完全清楚。

　　本研究利用大鼠烧伤模型，观察烧伤和LPS刺激AM释放TNFα、IL6的细胞信号传导机制。研究发现，在烧伤与LPS注射后，烧伤大鼠在体AMCD 14 mRNA表达均相应显著升高，据此推测，烧伤后血清内LPS浓度显著升高，以及AM细胞膜表面其受体CD14转录和翻译过程增强导致蛋白含量、受体数量增加，使得LPS对机体免疫系统的激活作用被绝对或相对放大，致使炎性介质大量释放，从而引起SIRS的发生。为佐证这一观点，本研究设计烧伤血清刺激体外培养AM，以模拟单纯烧伤后AM的液体环境。结果发现，烧伤血清和LPS均能刺激体外培养的AM释放TNFα和IL6，该效应可以被CD14抗体所阻断，由此进一步证实了上述推测，其与在体AMCD14的表达及调控情况类似[7]。这也提示，通过对CD14的调控，有可能控制严重烧伤后细胞因子的过量合成和分泌，从而降低肺部ARDS及SIRS的发生率。

　　目前已有关于通过调控烧伤后炎性细胞因子的释放以抑制过度炎症反应的研究报道[8]。在临床对阻断细胞因子过量分泌仍缺乏有效方法的情况下，通过调控LPS的受体CD14的表达，以达到抑制细胞因子的过度合成，具有极大的应用价值，值得进一步探索。

　　【参考文献】

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　　[8] 王光毅,夏照帆,朱世辉,等. 尼莫地平抑制烧伤大鼠促炎性细胞因子产生的观察[J]. 中华烧伤杂志, 2002,18(5):311311.