先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白5成熟肽基因突变研究

　　作者：张娇，沈浩，章庆国 作者单位：东南大学附属中大医院 整形外科，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的:探讨骨形态发生蛋白5(BMP5)成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。方法:收集临床确诊的散发先天性小耳畸形患者35例，用Trizol提取外周血白细胞总RNA，利用反转录聚合酶链反应单链构象多态性分析(RTPCRSSCP)技术进行BMP5成熟肽基因的突变分析，对异常电泳条带的RTPCR产物进行核苷酸序列测定，明确突变位点和方式。结果:从35例先天性小耳畸形患者中检测到1种错义突变：第 213位点发生TTTT→ACAC突变，编码氨基酸改变为苯丙氨酸→组氨酸。 结论:检测到的BMP5成熟肽基因突变可能为致病突变，其与先天性小耳畸形发病的关系有待于进一步研究。

　　【关键词】 先天性小耳畸形;骨形态发生蛋白5成熟肽基因;突变

　　先天性小耳畸形(microtia)也称小耳畸形综合征，其临床主要表现为外耳形态改变，外耳的基本结构消失或部分消失，仅有残余耳软骨及部分耳垂，甚至没有上述结构，而且常伴有外耳道闭锁、中耳畸形和颌面部畸形等症状，小耳畸形以单侧较多见。先天性小耳畸形在我国是一种较常见的先天畸形，发病率约为1/7000 ，在头面部先天畸形中位居第二，仅次于先天性唇腭裂畸形。先天性小耳畸形家族性病例少见，多以散发病例出现[12]。Kingsley等[34]曾先后发现小鼠小耳畸形的出现与骨形态发生蛋白5(BMP5)成熟肽基因突变密切相关。本研究应用反转录聚合酶链反应单链构象多态性分析(RTPCRSSCP)、DNA测序实验方法检测BMP5成熟肽基因在先天性小耳畸形患者中的突变情况，以探讨BMP5成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象收集2003~2005年度东南大学附属中大医院整形外科先天性小耳畸形患者43例，男性33例，女性10例，年龄6~22岁。其中双侧耳畸形2例，伴有颅面短小者5例。所有患者均来自于江苏、安徽两省，皆为汉族人，无家族病史。

　　1.2 仪器及试剂Eppendorf基因扩增仪、冷冻高速离心机(German)，DYY8C型高压双稳电泳仪、DYCP31C型琼脂糖水平电泳槽、DYCZ28A型夹芯式垂直槽(北京六一仪器厂)，ImageMaster VDS图像分析系统(USA)。Trizol试剂(上海生工生物工程有限公司)，RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(大连宝生物工程有限公司)，丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、TEMED、甲酰胺(南京生兴生物工程有限公司)。

　　1.3 研究方法

　　1.3.1 引物 依据GenBank中BMP5成熟肽基因序列(GI：24797149)设计两对引物，由上海捷倍思基因技术有限公司合成。引物 a：上游为5′CAAGGCG AGTGAGGTACTTC3′，下游为5′TTCATATGGGCGTT AAGTGG3′，扩增片断长度为270bp。引物 b：上游为5′CTATGTGAGCTTCCGGGATC3′，下游为5′GTGG CAGCCACATGAGCGTAC3′，扩增片断长度为289bp。

　　1.3.2 模板制备 取先天性小耳患者外周血1ml，用Trizol氯仿异丙醇法提取有核细胞中总RNA，25μl DEPC水溶解，-70℃保存作为RTPCR反应模板。

　　1.3.3 RTPCR反应 反应体积50μl。引物a反应组成分为：总RNA 2μl，MgCl2 1mmol·L-1，10×RTBuffer 1μl，Rnase Free H2O 275μl，dNTP 02mmol·L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 025U，oligo dT 125pmol，5×PCRBuffer 10μl，灭菌蒸馏水 2775μl，Ex Taq 125U;上下游引物各 02pmol·μl-1。反应程序为:30℃ 10min，45℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，94℃预变性2min，然后按94℃ 30s、54℃ 30s和72℃ 1min共进行35个循环，最后72℃延伸5min。引物b反应组成分为：总RNA 2μl，MgCl2 15mmol·L-1，10×RTBuffer 1μl，Rnase Free H2O 275μl，dNTP 02mmol·L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 025U，oligo dT 125pmol，5×PCRBuffer 10μl，灭菌蒸馏水 2675μl，Ex Taq 125U;上下游引物各 02 pmol·μl-1。反应程序为:30℃ 10min，45℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，94℃预变性2min，然后按94℃ 30s、54℃ 10s和72℃ 1min共进行35个循环，最后72℃延伸5min。对每个样本重复扩增3次，确保结果的可重复性。

　　1.3.4 RTPCR反应产物检测 取PCR产物5μl，2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电泳条件为电压100V，时间45min，用ImageMaster VDS图像分析系统观察产物片段。

　　1.3.5 SSCP分析 取RTPCR产物6μl，与上样缓冲液(95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mmol·L-1 EDTA)2μl混合，98℃变性10min后立即置于冰浴中，5min后分别上样于8%和12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为49∶1)，于1×TBE缓冲液中室温(10℃)150V恒压电泳15h。依次用固定液(10%乙醇)振荡10min、双蒸水漂洗3次，加脱色液(1.1%硝酸)振荡3min、双蒸水漂洗3次，然后加银染液(0.1%硝酸银)于摇床上染色30min，双蒸水短暂漂洗2次，再加显色液(2.5%碳酸钠、0.02%甲醛、2μg·ml-1硫代硫酸钠)振荡直至出现清晰条带，迅速用终止液5%冰醋酸终止反应。观察各标本DNA两条单链电泳迁移率，并与正常对照相比较，确定有无异常。

　　1.3.6 DNA测序 将SSCP异常泳动的标本交由上海博亚生物技术有限公司进行测序分析。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR扩增产物分析引物 a、b的扩增产物分别为270、289bp的DNA片断(图1、2)。M为Marker;1、2均为RTPCR产物

　　2.2 SSCP试验发现有1例先天性小耳畸形患者BMP5成熟肽基因泳动异常(图3)。N为正常对照，箭头所指为异常电泳条带将SSCP试验泳动异常的标本进行正、反向DNA测序，再将测序结果与GenBank中的BMP5成熟肽基因序列(GI：24797149)相对照，结果发现异常标本BMP5成熟肽基因在213位点发生TTTT→ACAC突变(图4，箭头所指)，以5′→3′为编码链，ATG为起始码，则发生TCT→TCA突变，其编码的氨基酸仍为丝氨酸，但TTT→CAC突变，则编码的氨基酸由苯丙氨酸变为组氨酸。

　　3 讨 论

　　从发育生物学的角度来看，耳廓是由胚胎期第一和第二鳃弓组织衍化而来的。在胚胎第3周后，第一鳃弓后缘和第二鳃弓前缘各自有3个结节状隆起，各隆起间组织增生形成前后两条皱襞，其上端相互融合，这6个结节按照顺时针方向分别发育成耳屏、耳轮脚、耳轮上部和下部、对耳屏及耳垂，从胚胎第6周到第12周耳廓基本形成[5]。先天性小耳畸形是一种多基因遗传病，即由许多对微效累加基因和环境因素共同作用而引起的一种疾病，其发病机制尚不十分清楚。一般认为环境因素和(或)遗传因素的作用影响了胚胎期第一和第二鳃弓组织的正常发育，从而导致了小耳畸形的出现。在环境因素研究中，曾有学者发现糖尿病患者、怀孕初期病毒感染、先兆流产、妊娠初期使用致畸剂如镇静剂、视黄酸、13顺维生素A等有可能导致耳颌畸形患儿出生[610]。Poswillo于1975年通过动物实验发现，镫骨动脉在胚胎发育期出现血管畸形影响了第一、二鳃弓的正常发育，导致耳颌畸形[11]。而其它一些动物实验则提示，遗传因素可能在先天性小耳畸形的发病方面也起了一定的作用。如1994年Naora等[12]研究发现第10染色体的一个插入突变导致半合子小鼠出现耳颌畸形的表型;同年，日本的Kurihara等[13]研究发现内皮素1基因突变的纯合子小鼠也有耳颌畸形的表型，以及BMP5基因突变导致的短耳小鼠畸形等。BMP5基因定位于染色体6p12.1，由7段外显子组成，在启动高等动物骨骼的形态发生中具有重要作用，在骨骼凝聚区的形成中表达最早，是启动骨骼凝聚区形成的重要原因，在促进间充质细胞凝聚的过程中具有重要的诱导作用，并可诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化。然而根据目前对短耳小鼠BMP5基因致病突变的研究以及对BMP5功能的一些了解，提示BMP5基因突变可能与短耳小鼠小耳畸形发病有关[34]。由此，本研究将编码BMP5功能蛋白的成熟肽基因作为检测对象，探讨BMP5成熟肽基因突变与人类先天性小耳畸形发病的关系。本研究中检测到的突变(213TTTT→ACAC)导致72 Phe→His，因此为一种错义突变，考虑到该突变位于编码BMP5功能蛋白的成熟肽区，可能影响了BMP5功能蛋白的正常作用，故怀疑此突变为致病突变。由于检测到突变的患者为单侧小耳畸形，不伴有颅面短小症状，并且本研究所搜集的35例患者BMP5成熟肽基因突变率较低(29%)，故尚不能说明BMP5成熟肽基因突变与先天性小耳畸形的发病有关，需进一步检测是否先天性小耳畸形患者BMP5基因启动子、调控区域会存在突变从而影响成熟肽基因的表达以及患者BMP5蛋白是否存在功能缺陷，并且需进一步扩大样本量，并与正常人群中BMP5成熟肽基因突变状态进行比较，以探讨BMP5成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。

　　【参考文献】

　　[1]张涤生.先天性小耳畸形[M]//张涤生.整复外科学.上海：上海科学技术出版社，2002：379.

　　[2]庄洪兴.小耳畸形综合症[M]//王炜.整形外科学.杭州：浙江科学技术出版社，1999:1066.

　　[3]KINGSLEY D M，KING J A，MARKER P C，et al.BMP5 and the molecular，skeletal，and softtissue alterations in short ear mice[J].Dev Biol，1994，166:112122.

　　[4]MARKER P C，SEUNG K，BLAND A E，et al.Spectrum of bmp5 mutations from germline mutagenesis experiments in mice[J].Genetics，1996，145:435443.

　　[5]张涤生.外耳的局部解剖[M]//张涤生.整复外科学.上海：上海科学技术出版社，2002:370.

　　[6]CASTILLA E E，LOPEZCAMELO J S，CAMPANA H.Altitude as a risk factor for congenital anomalies[J].Am J Med Genet，1999，86:914.

　　[7]EWARTTOLAND A，YANKOWITZ J，WINDER A，et al.Oculoauriculovertebral abnormalities in children of diabetic mothers[J].Am J Med Genet，2000，90: 303309.

　　[8]CLOUTHIER D E，WILLIAMS S C，YANAGISAWA H，et al.Signaling pathways crucial for craniofacial development revealed by endothelinA receptordeficient mice[J].Dev Biol，2000，217(1):1024.

　　[9]MOERIKE S，PANTZAR J T，de SA D，et al.Temporal bone pathology in fetuses exposed to isotretinoin[J].Pediatr Dev Pathol，2002，5(4):405409.

　　[10]WEI X，MAKORI N，PETERSON P E，et al.Pathogenesis of retinoic acid induced ear malformations in primate model[J].Teratology，1999，60(2):8392.

　　[11]POSWILLO D.Hemorrhage in development of the face[J].Birth Defects Orig Art Ser，1975，11(7):6181.

　　[12]NAORA H，KIMURA M，OTANI H，et al.Transgenic mouse model of hemifacial microsomia: cloning and characterisation of insertional mutation region on chromosome 10[J].Genomics，1994，23:515519.

　　[13]KURIHARA Y，KURIHARA H，SUZUKI H，et al.Elevated blood pressure and craniofacial abnormalities in mice deficient in endothelin1[J].Nature，1994，368:703710.