添加丙氨酰谷氨酰胺胃肠外营养对烫伤大鼠空肠黏膜及蛋白质代谢的作用

　　作者：桑剑锋，吴文溪，许勤，华一兵，丁强，周守贵 作者单位：南京医科大学第一附属医院 烧伤外科，江苏 南京 210029

　　【摘要】 目的：探讨添加丙氨酰谷氨酰胺(AlaGln)全胃肠外营养(TPN)对烫伤大鼠空肠黏膜及蛋白质代谢的影响。方法：将33只SD大鼠随机分为非烫伤正常参照组(正常组)、传统TPN组(传统组)和添加二肽TPN组(二肽组)3组，每组11只。正常组自由饮食，另两组大鼠在颈外静脉插管后行30%体表面积Ⅲ度烫伤，并接受等热量(780 kJ·kg-1·d-1)等氮量(氮量1.8 g·kg-1·d-1,二肽组48%的氮量由AlaGln提供)TPN 7 d，留取24 h尿测每日氮平衡和累积氮平衡;7 d后取血测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PAB)、转铁蛋白(TRF)，高效液相色谱法检测肌肉中谷氨酰胺(Gln)的含量;取一段空肠作黏膜形态学观察。结果：血清PAB、TRF及肌肉中Gln含量二肽组明显高于传统组(P<0.01);空肠黏膜绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度、绒毛表面积二肽组明显高于传统组(P<0.01)。结论：烫伤大鼠应用添加AlaGln的TPN能改善机体氮平衡，促进机体蛋白质合成，减缓肌肉中Gln含量的下降，减轻空肠黏膜的萎缩。

　　【关键词】 丙氨酰谷氨酰胺; 全胃肠外营养; 小肠黏膜; 烧伤; 代谢; 大鼠

　　谷氨酰胺(glutamine,Gln) 是体内含量丰富的游离氨基酸，它是小肠黏膜上皮细胞及所有快速增生细胞特别是免疫细胞的能源物质，被认为是机体在应激状态下的“条件必需氨基酸”。烫伤时机体出现应激反应，表现为体内蛋白质，尤其是骨骼肌蛋白质分解和尿氮排泄增加，Gln消耗增加，血浆及组织中Gln浓度下降。应激状况下，补充Gln有可能改善机体氮平衡、促进机体蛋白质合成、减轻小肠黏膜的萎缩。但Gln水溶解度低，且不稳定，在加热灭菌时生成有毒的焦谷氨酸和氨[1]，限制了其在肠外营养中的使用，而丙氨酰(Ala)Gln二肽克服了以上缺点，进入体内很快生成Gln。本实验观察了添加AlaGln的全胃肠外营养(TPN)对烫伤大鼠蛋白质代谢及空肠黏膜的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组

　　33只雄性SD大鼠，体重200～250 g，随机分为非烫伤正常参照组(正常组)、传统TPN组(传统组)和二肽TPN组(二肽组)3组，每组11只。

　　1.2 中心静脉置管

　　禁食24 h后，传统组和二肽组大鼠称重，在2%氯氨酮(100 mg·kg-1)腹腔内注射麻醉后，以8%～10%硫化钠水溶液脱去颈、背部的毛，温水擦净，碘伏消毒皮肤后，右颈部作纵形切口，显露右侧颈外静脉，远端结扎，近端插入外径1.2 mm、内径0.6 mm的硅胶管至上腔静脉(插入1.0～2.0 cm)。硅胶管自皮下隧道从背部肩胛间皮下引出后接保护弹簧及自制旋转装置。正常组不置管。

　　1.3 烫伤模型制作和饲养

　　根据公式S=0.091×W2/3 [S为体表面积(m2)、W为大鼠体重(kg)]计算出大鼠体表面积。在大鼠仍处于麻醉状态下，将传统组和二肽组大鼠已行脱毛处理的背部浸入100 ℃水中12 s，造成30%体表面积的Ⅲ度烫伤。伤后立即腹腔内注射林格液2.5 ml·(100 g)-1，置入代谢笼，自中心静脉置管用微量注射泵持续注林格液11.25 ml·(100 g)-1抗休克治疗。正常组不做烫伤模型，置入笼中自由饮食。饲养室内温度保持在25 ℃左右，每天保持约12 h光照，紫外线消毒室内空气每天1次，酒精擦洗代谢笼以保持代谢笼清洁，每天碘伏消毒烫伤创面和手术切口。

　　1.4 营养支持

　　传统组和二肽组大鼠接受等热量等氮量TPN：热量780 kJ·kg-1·d-1，采用葡萄糖和脂肪乳剂(30%英特利匹特，华瑞公司生产)双能源3∶2比例提供。氮量1.8 g·kg-1·d-1,传统组氮源由8.5%乐凡命(华瑞公司生产)供给，二肽组氮源由8.5%乐凡命中添加AlaGln(费森尤斯公司生产的20%力肽提供，其中力肽提供的氮量占总氮量的48%)。非蛋白热量∶氮量=434 kJ∶1 g;两组TPN液中均加入适量的水溶性和脂溶性维生素、微量元素、电解质、胰岛素(按每10 g葡萄糖1 U给予)，配方见表1。自中心静脉插管用微量注射泵均匀持续输注TPN液，烫伤当日每天每100 g体重给予11.25 ml。第2～7天每天每100 g体重22.5 ml。第8天晨处死大鼠取标本。表1 传统组和二肽组TPN营养液配方

　　1.5 标本收集与检测

　　1.5.1 体重变化 第8天大鼠称重，观察TPN前后的体重变化情况。

　　1.5.2 血生化检查 腹主动脉穿刺取血，置入干燥管中，血凝后离心20 min(1 500 r·min-1)，取上清-20 ℃冷冻保存，采用全自动生化分析仪检测血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G),免疫浊度法检测前白蛋白(PAB)、转铁蛋白(TRF)。

　　1.5.3 肌肉组织中Gln含量的测定 取大腿肌肉1块，立即液氮冷冻，移入-80 ℃ 深低温冰箱保存，集中用高效液相色谱法测定肌肉中Gln的含量[2]。

　　1.5.4 氮平衡和累积氮平衡测定 收集大鼠24 h尿液，微量凯氏定氮法测出24 h尿液中氮量。氮平衡(g·kg-1)=[入氮量(g)-出氮量(g)]/体重(kg)。TPN时，入氮量即营养中氨基酸的含氮量，出氮量主要为24 h尿液中的氮量。

　　1.5.5 空肠黏膜形态学观察 距Treitz韧带8 cm处取一段空肠，10%福尔马林溶液固定，常规病理切片，于光镜下用多媒体彩色病理图文分析系统测量绒毛高度(VH)、绒毛宽度(VW)、隐窝深度及黏膜厚度，根据公式计算出绒毛表面积(VSA)：VSA=л×VW×VH。每张切片随机测量5个绒毛，取平均值。

　　1.6 统计学处理

　　全部数据以x-±s表示，统计由SPSS软件包完成。传统组和二肽组体重变化，3组大鼠血清蛋白质浓度、肌肉Gln含量、每日氮平衡和累积氮平衡、空肠形态学之间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 传统组和二肽组TPN前后体重的变化

　　大鼠TPN后体重均下降，传统组尤为明显(t=5.65,P<0.01),二肽组也有下降(t=3.13,P<0.05)，两组间差异无统计学意义，见表2。 表2 传统组和二肽组体重变化与TPN前相比，1)P<0.01，2)P<0.05

　　2.2 血清蛋白质浓度

　　传统组和二肽组血清TP、ALB均比正常组明显降低(P<0.05或P<0.01)，二肽组PAB、TRF比正常组和传统组明显升高(P<0.01)，见表3。2.3 肌肉Gln含量

　　正常组、传统组及二肽组肌肉Gln含量依次为(1.84±0.32)、(1.31±0.09)及(1.60±0.22)μmol·g-1。经检验，传统组明显低于正常组(t=5.29，P<0.01)，二肽组也低于正常组(t=2.09，P<0.05),但明显高于传统组(t=4.05，P<0.01)。

　　2.4 传统组和二肽组每日氮平衡和累积氮平衡

　　第2、4、5天每日氮平衡两组间差异有统计学意义(P<0.01)，第2～7天累积氮平衡两组间差异亦有统计学意义(P<0.01)，其它时间两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表4、5。

　　2.5 小肠形态学改变

　　小肠黏膜VH、隐窝深度、黏膜厚度及VSA 3组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表6。表3 3组大鼠血清蛋白质浓度 表4 传统组和二肽组每日氮平衡(x-±s) g·kg-1 表5 传统组和二肽组累积氮平衡表6 小肠形态学改变

　　3 讨 论

　　烫伤应激状态下，儿茶酚胺大量释放，胰高血糖素及皮质类固醇分泌增加，胰岛素样生长因子1相对减少，外周组织发生胰岛素抵抗，甲状腺素分泌减少;某些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL1、IL6)等生成增加。另外一氧化氮、氧自由基、前列腺素等也在应激代谢中起了一定作用。在这些因素的共同参与下，机体呈分解代谢状态，蛋白质分解相对增加，合成相对减少，尿氮排出增加。

　　Gln是血浆和细胞内含量最丰富的游离氨基酸，而骨骼肌几乎含有体内一半的游离氨基酸，其中Gln占60%以上。烫伤应激时机体骨骼肌迅速分解并释放Gln入血，供肠、肝、肾等脏器使用，但应激时这些脏器Gln的消耗增加[3]，这必然导致血浆和组织，尤其骨骼肌中的Gln含量下降，因而本实验中传统组与二肽组大鼠骨骼肌Gln含量明显低于正常组。这部分是由于应激时糖皮质激素分泌增加的结果。有人实验证明，地塞米松能使犬后腿肌肉内Gln 和Ala 释放增加近4倍。另外IL1、TNF及其他细胞因子也参与作用。本实验表明，二肽组大鼠肌肉Gln含量明显高于传统组，添加二肽有效地增加了肌肉中Gln的含量。有研究证明，肌肉中Gln含量与肌肉蛋白合成成正比，与蛋白分解成反比，因而肌肉中Gln含量的相对增加，可有效地防止肌肉的萎缩。

　　血清ALB影响因素较多，且半衰期长约20 d，对营养状况和蛋白质代谢的短期变化不敏感;而TRF半衰期较短，约为8 d，是评价蛋白质营养状况比较敏感的指标;PAB半衰期更短，为12 h，能较快地反映机体蛋白质营养状况。本实验表明，传统组和二肽组大鼠血清ALB明显低于正常组，这与某些细胞因子如IL6的增加导致肝细胞内ALB mRNA浓度下降有关。二肽组PAB、TRF明显高于传统组和正常组，说明添加二肽TPN可促进蛋白合成。值得一提的是：本实验中，除第1天部分大鼠呈负氮平衡，其余两组均呈正氮平衡，这可能是由于烫伤创面坏死组织及创面下渗出液无法收集，不能计算这两者所损失的氮;另外TPN液中给予的氮量较多也是原因之一。与传统组相比，二肽组第2、4、5天氮平衡和第2～7天累积氮平衡明显改善，且差异显著。这些表明添加二肽的TPN明显改善了机体氮平衡，促进了机体蛋白质的合成。

　　长期TPN可导致肠黏膜萎缩、肠黏膜渗透性增加、肠道免疫功能障碍和肠道细菌移位。本实验中传统组和二肽组小肠黏膜VH、黏膜厚度、隐窝深度和VSA明显低于正常组，表现出TPN后肠黏膜萎缩的不良反应。但二肽组的以上指标又明显高于传统组，这说明AlaGln能减轻小肠黏膜萎缩，其可能机制：(1)AlaGln提供了小肠吸收利用的Gln，提供了氧化利用的能源和用于合成嘧啶、嘌呤等的氮源，有助于小肠上皮细胞分裂复制。(2)Gln能促进某些激素如蛙皮素、神经降压素、肠高血糖素的释放。高血糖素能提高小肠谷氨酰胺酶的活性，从而促进Gln的消耗利用;Gln还能刺激胰腺和胆汁分泌，它们在小肠上皮细胞生长中起重要作用。(3)Gln能防止肠上皮细胞凋亡[46]。

　　综上所述，烫伤大鼠应用添加AlaGln的胃肠外营养能改善机体氮平衡，促进机体蛋白质合成，减少肌肉中Gln含量的下降，减轻空肠黏膜的萎缩。

　　【参考文献】

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