烧伤对不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白的影响

　　作者：郭晓强，郭佩，张彩云，刘卫 作者单位：1. 白求恩军医学院生物化学教研室，河北石家庄 050081;2. 河北师范大学生命科学院，河北石家庄 050016

　　【摘要】目的 研究不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白烧伤前后的变化。方法 90℃水蒸气制备烧伤小鼠模型，采用比色法测定烧伤小鼠肝脏和脾脏中的铁含量，逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测肝脏hepcidin和膜铁转运蛋白1(Fpn1)表达，使用Western检测了肝脏和脾脏Fpn1蛋白表达。结果 烧伤后雄性小鼠脾脏铁含量升高，肝脏hepcidin表达升高同时肝脏和脾脏Fpn1蛋白含量减少。烧伤后雌性小鼠铁内稳态破坏程度较轻。结论 铁相关蛋白的表达变化可能是引起烧伤后铁内稳态破坏的重要原因，不同性别小鼠铁相关蛋白表达差异可能暗示了雌激素的保护作用。

　　【关键词】 烧伤 铁 hepcidin 膜铁转运蛋白

　　The effect of burns on ironrelated proteinsin liver and spleen of different sex mice

　　GUO Xiaoqiang, GUO Pei, ZHANG Caiyun, LIU Wei

　　1. Department of Biochemistry, Bethune Military Medical College, Shijiazhuang 050081;

　　2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the changes of ironrelated proteins in different sex mice before and after burns. Methods The burn model in mice were prepared with 90℃ vapor. Both liver and spleen iron contents were measured by colorimetric method. Hepatic hepcidin and Fpn1 mRNA content were determined with RTPCR. The Fpn1 protein was determined with Western blot. Results After burns, the content of spleen iron was increased and the expression of hepatic hepcidin was decreased in male mice, and at the same time the Fpn1 of liver and spleen was reduced. The content of iron homeostasis abnormality in female mice was less serious. Conclusion The change of ironrelated proteins after burns may be one cause of iron homeostasis abnormality. The differences of ironrelated protein expression in different sex after burns suggest that estrogen has a potentially protective function.

　　KEY WORDS: burn; iron; hepcidin; ferroportin 1

　　铁是生物生长和发育所必需的元素之一，其缺乏可造成贫血和细胞凋亡[1]。烧伤性贫血是一种炎症性贫血，是严重烧伤的常见并发症，常见临床特征包括贫血、血清铁含量下降、巨噬细胞铁滞留等[2]，这是由于烧伤引起的炎症反应可破坏机体铁的内稳态。目前已发现多种与铁内稳态相关蛋白，如hepcidin[3]、膜铁转运蛋白1(ferroportin 1, Fpn 1)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor1, TfR1)等[4]，这些蛋白共同调节了机体铁的内稳态。前期研究已确定hepcidin在烧伤性贫血发生过程中发挥着重要作用，而本实验目的在于进一步确定烧伤对铁相关蛋白及组织铁含量的影响，另外还确定烧伤对不同性别小鼠铁代谢影响的差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　2月龄KM小鼠(清洁级)购自河北省实验动物中心，体重25～27g，雌雄各半;试剂亚铁嗪(ferrozine)、Trizol试剂盒、AMV逆转录酶、PCR引物、DEPC等均购自上海生工生物工程技术有限公司，小鼠Fpn1一抗为Alpha Diagnostic公司产品，TfR1一抗为invitrogen产品，actin一抗为Sigma生产，HRP标记的羊抗小鼠二抗购自北京中山金桥，发光底物为Pierce公司产品，其他试剂为国产分析纯。1.2 烧伤模型小鼠的制备 将12只小鼠先雌雄分开，然后1/2雌雄小鼠进行烧伤处理，另外1/2作为对照。先对所有小鼠背部使用Na2S进行脱毛处理(面积占体表总面积30%)，12h后对烧伤组小鼠裸露处用90℃水蒸气处理15s，基本达到深Ⅱ度和Ⅲ度烧伤，对照组小鼠使用室温蒸馏水处理相同时间。处理完毕后对所有小鼠禁食(减少肝糖原)，但保留水供应。12h后将所有小鼠处死，取脾脏和肝脏备用。

　　1.3 小鼠肝脏和脾脏铁含量的测定

　　参照文献[5]并做适当修改。称取10mg干燥肝脏或脾脏组织并研碎，将其溶于100mL盐酸和300mL/L三氯醋酸混合液(1∶1)，随后使用超声处理(10s，3次)，95℃水浴30min，离心取上清。96孔板中依次加入水(空白对照)、铁标准液(84.7μmol/L)和组织上清液50μL，然后加入含10mmol/L亚铁嗪和32.6mmol/L抗坏血酸TrisHCl缓冲液(浓度50mmol/L，pH 4.0)50μL，37℃反应15min，用酶联免疫检测仪595nm测定各孔吸光度，将结果换算成铁浓度并计算单位克组织中肝脏和脾脏的铁含量。

　　1.4 肝脏hepcidin和Fpn1 mRNA的RTPCR测定

　　取适量小鼠肝脏组织先用Trizol试剂盒提取RNA，再通过逆转录获得cDNA，然后利用PCR扩增。Hepcidin和actin扩增20个循环(94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min)，Fpn1扩增29个循环(94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s)。将所得PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果使用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。所用PCR引物为：

　　Hepcidin：Forward为CCTATCTCCATCAACAGATG;Reverse为AACAGATACCACACTGGGAA

　　Fpn1：Forward为ACAAACAAGGGGAGAACGC;Reverse为ATGACGGACACATTCTGAACCA

　　βactin：Forward为AGCCATGTACGTAGCCAT

　　CC;Reverse为TTTGAGGTCACGCACGATTT

　　1.5 肝脏和脾脏Fpn1以及肝脏TfR1的Western blot测定

　　100mg组织先用蛋白裂解液1mL处理，所得溶液使用考马斯亮蓝G250测定蛋白浓度，以保证蛋白上样量为50μg。100g/L的SDSPAGE分离胶分离，300mA转膜45min，将NC膜用脱脂奶粉室温处理2.5h，一抗4℃过夜，二抗室温2h，化学发光显带，并将结果记录。

　　1.6 统计学处理

　　小鼠肝脏和脾脏铁含量、小鼠肝脏hepcidin和Fpn1的mRNA相对含量数据采用成组设计的定量资料t检验分析，结果用柱形图显示。

　　2 结 果

　　2.1 烧伤后小鼠肝脏和脾脏铁含量的变化

　　组织铁测定显示：烧伤后雄性小鼠肝脏铁虽有微量升高但差异不显著，而脾脏铁明显增加(P<0.05，图1)，正常雌性小鼠的肝脏铁和脾脏铁含量都高于正常雄性，差异有统计学意义(P<0.05)，然而烧伤后两种组织铁含量升高都不明显。

　　2.2 烧伤对小鼠肝脏hepcidin和Fpn1表达的影响

　　RTPCR结果显示：雄性小鼠烧伤后肝脏hepcidin的mRNA相对值(以βactin为内参照)明显增加(*P<0.05)，但Fpn1没有明显变化(图2);正常雌性小鼠hepcidin相对值低于正常雄性(*P<0.05)，烧伤后也出现显著升高(#P<0.05，图2)，但同时Fpn1表达也明显增加(#P<0.05，图2)(注：*表示与正常雄性小鼠比较，而#表示与正常雌性小鼠比较)。

　　2.3 烧伤对小鼠肝脏和脾脏Fpn1及肝脏TfR1蛋白含量的影响

　　Western blot显示：烧伤后雄性小鼠肝脏和脾脏Fpn1含量明显减少，然而肝脏TfR1却有一定程度增加;与此不同的是烧伤后雌性小鼠肝脏和脾脏Fpn1的蛋白含量下降都不显著，而肝脏TfR1却显著减少(图3)。

　　3 讨 论

　　烧伤是一种严重的机体损伤，可造成多种不良后果，铁代谢紊乱引发的贫血是其中之一。由于铁是血红蛋白生物合成的必需原料，它的含量减少使红细胞生成减少和机体抵抗力下降。随着铁代谢相关蛋白研究的深入，人们对铁内稳态调节分子机制的理解更加全面，这对烧伤性贫血发生机制的认识有重要帮助。本研究显示：烧伤可引起雄性小鼠hepcidin表达显著升高，同时肝脏和脾脏的Fpn1蛋白明显减少，肝脏TfR1却出现一定增加，脾脏铁滞留，肝脏铁少量增加(考虑到肝脏所占比重，少量增加对血清铁利用的影响也较为显著)，小鼠出现贫血。

　　相关研究表明烧伤可造成机体炎症的发生，而炎症可诱导hepcidin表达增加[3]。hepcidin是一种重要的机体铁内稳态负调节因子，它可诱导细胞铁输出蛋白Fpn1的内吞和随后的细胞内降解[6]，故Fpn1会随着hepcidin的增加而含量下降，从而造成细胞内铁输出减少。TfR1是位于细胞膜上的转铁蛋白受体，是组织的主要摄铁蛋白。已有研究证明炎症可诱导TfR1表达增加[7]，而本研究也得到相似结果。Fpn1和TfR1两种蛋白含量的这种变化趋势造成组织(尤其是肝脏和脾脏)铁摄入增加而排出减少，随后的结果是机体一方面出现组织铁滞留，另一方面造成血清可利用铁减少而出现贫血。

　　本研究还初步显示：烧伤对不同性别小鼠铁内稳态的影响存在差异。烧伤后雌性小鼠内稳态破坏程度明显低于雄性，从机体铁相关蛋白表达变化来看，二者也明显不同。正常雌性小鼠体内hepcidin较雄性小鼠低，而组织铁含量高于雄性，烧伤后尽管hepcidin表达出现增加，但同时Fpn1表达也增加，这可缓解因hepcidin表达增加诱导Fpn1降解而引起Fpn1蛋白减少的后果;Western blot也确定雌性小鼠烧伤后肝脏和脾脏Fpn1没有出现明显下降的趋势。此外烧伤后雌性小鼠的TfR1不升反降，这种变化可减少机体贫血状态下的血清铁摄入。雌雄小鼠铁蛋白表达的多方面差异使雌性小鼠烧伤后组织铁滞留较少，而血清可利用铁相对增多，故贫血程度较轻。

　　已知肝脏多种基因的表达都具有性别差异[8]。浓度测定显示hepcidin也具有这种特点，男性血清中hepcidin含量明显高于女性[9]。本实验也显示雄性小鼠hepcidin的mRNA相对值明显高于雌性。已有研究证明雌激素可抑制炎症引起的白介素6(IL6)表达增加[10]，而IL6是hepcidin表达的重要诱导因素之一，并且IL6诱导hepcidin需要转录信号转导子和激活子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)的参与[11]，而STAT家族多个成员参与了性别差异基因的表达[8]。结合这些分析可初步推断，雌激素可能参与了hepcidin的表达，此外雌激素与Fpn1和TfR1的关联尚无法确定，但可初步得出的结论是雌性小鼠烧伤后贫血程度较轻的一个可能原因是雌激素参与了铁相关蛋白的表达调节过程。

　　本研究初步说明烧伤造成的铁相关蛋白表达变化是造成烧伤性贫血发生的原因之一，而雌激素可能通过影响相关蛋白的表达而发挥对机体的保护作用。详细机制尚待进一步阐明。

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