基于三维CT图像重建研制纳米仿生骨基质支架的研究
发表时间：2010-02-23 浏览次数：668次
基于三维CT图像重建研制纳米仿生骨基质支架的研究作者：郭洪刚 刘静 李峰坦 刘海峰 姚芳莲 姚康德 作者单位：1.天津医科大学总医院骨科， 天津 300052;2.天津市中心妇产科医院，天津 300052；3.新加坡国立大学组织工程研究中心， 新加坡 117510；4.天津大学材料学院， 天津 300072；基金项目：天津市卫生局科技基金资助项目（编号：06KZ46) 【摘要】 ：［目的］分析数字化影像学技术辅助研制生物支架的可行性，评估构筑生物支架的方法。［方法］通过对宿主部位图像扫描，获取该区域解剖数据，对相邻层匹配轮廓间三维表面进行重构来确定支架形貌，以纳米级无机成分为单位，附于壳聚糖及聚己内酯等天然-有机成分，研制纳米复合支架。观察支架形貌、测定支架的孔隙率、亲水性及降解力学特性。［结果］图像三维重构可提高支架外部轮廓的精确度，减少单纯理化制备过程的参数误差，使支架空间三维布局更加合理，孔径200～350 μm，孔隙率88.6％±0.43％的支架拥有稳定的降解速率及良好的亲水表面，可达到工程化骨支架的力学要求，能作为骨再生修复的载体框架。［结论］数字化影像学技术研制的支架具有稳定的理化性征，能解决与宿主部位相匹配的难题，具有潜在的研究空间。 【关键词】 图像 三维重建 纳米 支架 Study on fabrication of biomimetic nanoscaled bone matrix by using imaging based three-dimensional constructionGUO Honggang,LIU Jing,LI Fengtan,et al.Department of Orthopaedic Surgery,Tianjin Medical Uinversity General Hospital,Tianjin 300052,China Abstract：［Objective］To analyze the feasbility of digitial imaging on scaffold fabrication.［Method］The morphology of scaffold was obtained by analyzing anatomic data on digital scanning in host area.Fabrication of biomimetic nanoscaled bone matrix was made with combination of chitosan and polycarpolactone and βTCP.Morphology,pore ratio,degradation and biomechanic characteristics were observed at different periods.［Result］The fabrication accuracy of outer morphology for scaffold was improved by using threedimensional construction of imaging,and its physical layout was remarkably arranged.As a satisfactory carrier for bone tissue engineering,pore ratio 88.61%±0.43% ranging from 200-350 μm of scaffola showed more stable degradation speed and excellent affinity surface.［Conclusion］Imaging aided fabrication technique has a good match between host and scaffold,showing vast research potential. Key words：iamging; threedimensional construction; nanoscale； scaffold 随着数字化影像学对临床应用的深入，基于医学图像的器官三维重构显得越来越重要。本研究拟从仿生策略出发，基于三维CT重建构筑生物支架外形轮廓，以纳米级无机成分为单位，附于壳聚糖及聚己内酯等天然-有机成分。从宏观与微观方面对支架进行仿真，测试支架空间布局、理化性征及生物力学，探讨数字化影像学技本辅助研制生物支架的可行性。1 材料与方法 1.1 横突间仿真支架的制备 收集正常兔脊柱标本，将样本置于精密螺旋三维CT系统(美国GE Lightspeed16)的扫描平台中，沿标本后柱结构方向扫描，获取连续薄层平面CT图像，精确测量横突间关节的解剖数据，经三维重建，提取其中的图像信息，按下列公式，调整支架三维尺寸规格，即以测定L5／6横突基底上下间距为支架长度，L5／6横突基底距上关节突基底间距为支架宽度(图1)，L5／6横突基底与该椎体间距离(轴位像)为支架高度(图2)，L5／6横突基底上下间距×L5／6横突基底距上关节突基底间距×L5／6横突基底与该椎体间距离(轴位像)=支架长度×支架宽度×支架高度(支架体积)，最终确定支架尺寸为长（10.21±1.31）mm，宽（3.21±0.81）mm，高（12.34±0.75）mm；利用沉淀、共混复合及冷冻干燥法制备出三维多孔纳米级β磷酸三钙／壳聚糖／聚己内酯(nβTCP-CS-PCL)框架材料支架。 1.2 支架形态学观察 将支架用利刀切开，以显示内部结构，行大体与扫描电镜(Hitachi s 520，Japan)观察其宏观及微观形貌。 1.3 支架孔隙率、密度测定 采用Zhang氏液体置换法［1］，用量筒量取V1体积的无水乙醇，取一定质量(W)的支架材料浸入其中，反复抽真空至无气泡溢出，此时量筒读数为V2，将含乙醇的支架材料移出后记所剩乙醇体积为V3，支架孔隙率(p)=(V1-V3)／(V2-V3)×100％，支架的密度d=W／(V2-V3)，测试3种不同孔径(100～150 μm，200～350 μm， 400～550 μm)支架的孔隙率及密度。 1.4 支架亲水性测定 取3块不同孔径支架称取质量(m0)，室温下置入5 ml去离子水中4 h，于1、2、4、8、12、24、48 h后取样品，用滤纸吸净样品表面水分，称其质量(m1)，计算吸水率：吸水率=(m1-m0)／m1×100％，绘制吸水率随时间变化的曲线。 1.5 降解测试 将支架样品完全浸泡在37℃、pH 7.4的0.1 mol／L磷酸盐缓冲液中进行降解试验，定期(1、2、4、8、12、24、48 h)取样测试支架质量丢失率及分子量。支架质量丢失率=(m0-mx)／m0×100％，其中m0为降解前质量，mx代表各时段质量结果，以三氯甲烷溶解样品，凝胶色谱测定分子量。 1.6 生物力学测定 采用三点弯曲法测量支架框架结构的抗弯强度、抗压强度及弹性模量。 1.7 统计学方法 单因素多水平方差分析和q检验。2 结 果 2.1 支架形态学观察 大体观察显示：支架外观白色，表面光滑，具备多孔蜂窝状结构，孔隙结构均匀，无缺损(图3)。 扫描电镜观察显示：支架呈现结构均匀的镂空状，支架的三维空间结构布局主要体现在排列规整的支架小梁(柱状结构)及连通性孔隙结构。前者(支架小梁)粗细均匀一致，支架小梁沿支架的长轴方向走行；后者(支架孔隙结构)表现为支架大孔周围布满了相互贯通的蜂窝状微孔结构，孔隙形貌为类圆形，且孔径大小均匀，网孔间相互沟通(图4)。 2.2 支架孔隙率、孔隙密度 支架孔径为100～150 μm的支架孔隙率为88.98％±0.32％，孔隙密度为（0.23±0.04）g／cm3；孔径为200～350 μm的支架孔隙率为（88.61±0.43）％，孔隙密度为（0.26±0.06）g／cm3；孔径为400～550 μm的支架孔隙率为（92.81±0.26）％，孔隙密度为（0.18±0.03）g／cm3；支架孔隙率和孔径与致孔剂用量呈正相关，即多孔材料的孔隙率、孔径随致孔剂用量增加而加大，而与材料中成分含量比无关。 2.3 支架亲水性 支架具有较强的亲水性，吸水后体积明显增加。孔径100～150 μm支架吸水率基本维持不变，大孔径(400～550 μm)支架吸水率比小孔径支架高，且随时间延长，其吸水率不断增加，至48 h达最大 值(268～48.9)％，吸水率随时间变化规律的曲线见图5。 2.4 降解测试 支架材料质量丢失率随降解时间延长而明显增加，大孔径支架质量丢失率显著高于中、小孔径支架组，所有支架质量并未完全丢失(表1)。支架分子量变化趋势见图6，分子量呈线性降低，降解前24 h，大孔径(400～550 μm)支架的分子量小于小孔径(100～150 μm)支架，24 h后，大孔径支架的分子量比中、小孔径支架大，表明降解后期，大孔径支架的降解速率降低。 2.5 生物力学性能分析 不同孔径支架框架的抗弯强度、抗压强度、弹性模量具有明显差异，孔隙率、孔径越大的支架其压缩强度和压缩模量越小，入选的孔径为200～350 μm孔隙率为88.61％±0.43％的支架，相对满足骨生物支架的力学要求(F抗弯强度=68.367 MPa，F抗压强度=4.556 MPa，F弹性模量=27.759 MPa，P<0.01，表2)。表1 不同孔径支架质量丢失率(略)注：*P<0.05，**P<0.01，(F*=9.596，F**=18.397)。表2 生物力学测试(n=6，MPa，±s)孔径支架抗弯强度（MPa)抗压强度（MPa)弹性模量（略)注：与100～150 μm、200～350 μm孔径支架相比，*P<0.01；与400～450 μm孔径支架比较，#P<0.05。3 讨 论 近年来，三维有限元、快速成型等的计算机辅助技术为支架研发提供了新的发展空间，但多数从宏观角度进行仿真，尺寸为微米级，且成分单一，仍存在内部构造与外形轮廓不匹配、理化性征不稳定等缺陷［1～3］。因此，除对支架宏观干预外，应对支架成分及结构方面进行微观调控，才能解决支架与宿主部位相匹配的难题。 骨是一种复杂的生物矿化体系，其无机成分晶体在纳米级，以有机质为模板形成有支持力的结构［4，5］。从仿生学角度，应维持骨组织研发品无机成分的纳米状态，聚合物具有良好的机械强度及较好的降解性能，能更好地模拟骨骼的强度，但疏水性表面不利于细胞粘附。为优化理化性能，有必要研发有机-无机或天然-有机-无机等复合类材料。磷酸三钙在体内降解产物呈碱性，能中和聚合物酸性的降解产物，壳聚糖可改善材料表面电荷，具备细胞、生长因子识别的位点，能增强细胞对材料粘附性，故此，将它们与聚己内酯类人工基质复合能得到优化性能的骨组织框架材料。 通过对宿主部位CT扫描，结合图像采集、分割及三维重建，获取该区域准确解剖数据，根据相邻层轮廓间的几何相似性和相对位置不变性等特征，确定相邻层轮廓之间匹配关系，并对相邻层匹配轮廓间三维表面进行重构来确定支架形貌，有望提高支架外部轮廓尺寸的精确度，减少单纯理化制备过程的参数误差，使支架空间三维布局更加合理，利于支架外部形态与宿主受损部位相匹配［6］。SEM结果表明，三维支架具备完全相通、有规则的内部孔隙及柱状结构，柱状结构类似小梁骨，具备一定的走行方向。这提示以影像学为基础的支架制备技术能准确地测定支架几何尺寸，维持支架外形轮廓及内部构造的稳定性。 孔径、孔隙率及孔的连通性是多孔材料的主要物理参数之一，目前有关多孔材料的孔径理想范围尚存在争议，但公认的看法是材料的孔隙大小应满足骨单位和骨细胞生长所需的空间［7］。骨组织长入的最低孔径为70 μm，低于100 μm无法长入，孔径大于200 μm是骨传导的基本要求，200～400 μm时有利于新骨生长。 吸水率是生物支架结构的一个综合指标，既反映出支架的有效孔隙率，又反映了自身的亲疏水性，吸水率高的生物支架，利于细胞进入内部孔隙。实验结果表明，支架孔径为100～150 μm时吸水率最小(相应孔隙率为88.98％±0.32％)，孔径在400～550 μm范围内，孔径越大吸水率越高。作者分析，支架孔径越小，水越难进入孔隙内部，孔径适中范围(200～350 μm)的支架其表面亲水性趋于稳定，吸水率维持恒定。生物材料的降解主要有两条途径，即溶液介导过程与细胞介导过程［8］。材料置于模拟体液中浸泡，只是单纯的溶解过程，材料溶解速度与材料微观结构及性能密切相关。如材料的化学成份、孔隙率、孔径以及孔之间的贯通性等均对材料溶解速度产生影响。材料的孔隙率决定着其内在表面积，孔之间的贯通性确保了内环境体液和细胞等与材料的大面积接触，故促进降解。 力学测试结果验证了孔隙率越高，材料力学性能就越低，高孔隙材料只能适应用于对力学要求较低的部位，不适应脊柱承重区域。孔径200～350 μm，孔隙率88.61％±0.43％的纳米复合支架可达到工程化骨支架的力学要求，并拥有稳定的降解速率及良好的亲水表面，这提示孔径适中的纳米级复合材料可作为骨组织再生修复的载体框架。综上所述，数字化影像学技术研制的支架具有稳定的理化性征，能解决与宿主部位相匹配的难题，具有潜在的研究空间。【参考文献】 ［1］Stops AJ,McMahon LA,O’Mahoney D，et al．A finite element predicition of strainon cells in a highly porous collagenglycosaminoglcan scaffold［J］．J Biomech Eng,2008,60：610-612． ［2］Quadrani P，Pasini A,Matiollibelmonte M，et al．Highresolution 3D scaffold model for engineered tissue fabrication using a rapid prototyping technique［J］．Med Biol Eng Comput，2005，2：196-199． ［3］Peltola SM，Melchels FP,Grijpma DW，et al．A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes［J］．Ann Med,2008,4：268-280． ［4］Fritsch A,Hellmich C．Universal microstructure patterns in cortical andtrabecular,extracellular and extravascular bone materials：micromechanicsbased prediction of anisotropic elasticity［J］．J Theor Biol,2007,40：597-620． ［5］Racila M,Crolet JM．Human conical bone：computer method for physical behavior at nanoscale constant pressure assumption［J］．Technol Health Care，2006，5：379-392． ［6］Ciocca L，DeCrescenzio F，Fantini M，et al．CAD／CAM and rapid prototyped scaffold construction for bone regenerative medicine and surgical transfer of virtual planning：a pilot study［J］．Comput Med Imaging Graph，2009，1：58-62． ［7］Bernhardt A，Despang F，Lode A，et al．Proliferation and osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells on alginategelatinehydroxyapatite scaffolds with an isotropic pore struture［J］.J Tissue Eng Regen Med,2009,1:54-62. ［8］Coimbra ME,Elias CN,Coelho PG.In vitro degradation of polyLDlactic acid(PLDLA) pellets and powder used as synthetic alloplasts for bone grafting［J］.J Mater Sci Mater Med,2008,10:3227-3234.
