胸腺肽对严重烧伤患者免疫功能调理的初步研究

作者：刘静杰，隋志甫，朱敬民，郝天智    作者单位：北京军区总医院烧伤整形科， 100038 　　【摘要】  目的 研究胸腺肽对严重烧伤患者的免疫调理作用。方法 选取30例严重烧伤患者(其中15例除常规治疗外还应用胸腺肽治疗)，分别于伤后3、7、14、28天抽取静脉血，酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)，并用流式细胞仪测定单核细胞表面人类白细胞DR抗原(HLADR)。结果 接受胸腺肽治疗的患者血浆IFNγ水平升高持续至停药后较长的一段时间，未接受胸腺肽治疗的患者IFNγ水平几乎测不出。接受胸腺肽治疗的患者与未接受胸腺肽治疗的患者外周血TNFα水平无显著差异。伤后7、14、28天接受胸腺肽治疗的患者单核细胞HLADR较未接受治疗组高。结论 胸腺肽对严重烧伤患者的免疫功能有明显改善。

　　【关键词】  胸腺肽;免疫抑制;抗原

　　Study of immune opsonization by thymic peptide in severe burned patients LIU Jingjie，SUI Zhifu，ZHU Jingmin，et al. (Department of Burns and Plastic Surgery,General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100038,China)

　　Abstract： Objective To study the immune opsonization of thymic peptide in severe burned patients.Methods The peripheral blood was drawn from 30 severe burned patients(15 of them were given 1.6mg thymic peptide every other day) on days 3,7,14,28 after injury.TNFα and IFNγ were measured by means of ELISA.The expressed HLADR of monocyte was measured by means of flow cytometry.Results The IFNγ of the patients who were given thymic peptide increased,which was not found in control group.The TNFα of the two groups had no significant difference.The HLADR in thymic peptide group was higher than that in control group.Conclusion Thymic peptide can largely improve the immune function of severe patients.

　　Key words:thymic peptide;immune inhibition;antigen

　　胸腺肽是来自于胸腺组织中的肽类成分，对胸腺依赖性淋巴细胞的分化、成熟起着重要的调节和控制作用。自被发现分离提纯以来，胸腺肽己广泛应用于多种临床免疫疾病，并且取得了一定的疗效。有研究表明[2，7]严重烧伤患者存在不同程度的免疫紊乱，临床工作者已开始关注胸腺肽对烧伤免疫功能的作用，胸腺肽己开始用于严重烧伤的治疗。本研究观察了应用了胸腺肽治疗的烧伤患者的细胞因子和人类白细胞DR抗原(HLADR)的变化，对胸腺肽对严重烧伤患者免疫功能影响进行评价。

　　材料与方法

　　1 观察对象

　　我科近年来的住院的特重度烧伤患者30例，年龄(32.4±5.8)岁，深Ⅱ°以上烧伤面积在50%～60%之间，其中Ⅲ°面积在40%～60%之间，伤前无器质性疾病。患者全部经正规治疗。其中15例重度烧伤患者，除常规治疗外，在伤后第3日(休克期过后)开始应用胸腺肽α治疗。用法为1.6mg，皮下注射，隔日1次，应用10次后停药。胸腺肽治疗组患者Ⅲ°烧伤面积平均为46%，常规治疗组患者Ⅲ°烧伤面积平均为47.5%，经统计二组伤情差异不显著。所研究病例治疗过程中病情平稳，均痊愈出院。

　　2 标本收集

　　根据临床实际,在不影响临床治疗,并考虑到患者承受程度的情况下,烧伤后3、7、14、28天静脉采血，采血时间均为清晨5:00～6:00，5%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，无菌操作。采血后留取0.5ml全血做HLADR的检测,其余立即分离血浆-70℃并保存。用于测定正常组、烧伤后各组患者的肿瘤坏死因子α(TNFα)及干扰素γ(IFNγ)的水平。

　　3 指标检测及方法

　　3.1 外周血浆TNFα、IFNγ水平测定 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血浆中TNFα、IFNγ水平(按操作说明书进行)，通过倍比稀释制作标准曲线依次加入抗体、标记二抗、显色底物，酶标仪在合适的波长(450nm)测定光密度值，根据标准曲线线性回归方程计算相应标本中TNFα、IFNγ含量。

　　3.2 用流式细胞仪检测单核细胞表面HLADR的表达 (1)0.5ml新鲜全血(采血后6小时内)加入5ml红细胞裂解液(KHCO3 1.0g,NH4Cl 8.3g EDTA 37mg加蒸馏水至100ml调整pH至7.4)，混匀，室温下静置15分钟，待溶液变清亮后，200g离心，弃上清。(2)以PBS(NaCl 8g;KCl 0.2g;NaHPO·7H2O 1.15g;KH2PO4加蒸馏水1000ml)溶液洗涤沉淀1次，加入PBS恢复体积至0.5ml;(3)加入10μl PECD14鼠抗人单克隆抗体充分混匀，再加入10μl FITCHLADR鼠抗人单克隆抗体充分混匀，室温避光孵育1小时;(4)PBS溶液洗涤2次;(5)定容至0.4ml，加入100μl 4%多聚甲醛固定;(6)用200目滤网将溶液过滤入流氏专用样品检测管中;(7)上流式细胞仪检测。

　　4 统计分析

　　数据以均数±标准差表示，用stata软件进行t检验和方差分析，P<0.05为差异显著;P<0.01为差异非常显著特重度烧伤患者外周血浆IFNγ水平变化。

        结 果

　　1 健康人血中测不出IFNγ和TNFα。

　　2 给予胸腺肽α治疗的患者血中IFNγ水平升高并持续停药以后，伤后28日后可测出，未给予胸腺肽α仅给予常规治疗的患者，血中测不出IFNγ(见表1)。

　　3 给予胸腺肽α治疗的患者血中TNFα水平较对照组低，但二者差异无显著意义(见表2)。

　　4 治疗早期二组单核细胞表面HLADR均处于较低水平，随着治疗和伤情的好转，HLADR逐渐升高。给予胸腺肽α治疗患者的单核细胞表面HLADR较未用胸腺肽α治疗的患者单核细胞表面HLADR恢复快(见表3)。表1 胸腺肽治疗对特重度烧伤患者外周血　IFNγ水平影响表2 胸腺肽对特重烧伤患者血浆TNFα水平影响表3 胸腺肽对特重烧伤患者HLADR表达率的影响

　　讨 论

　　严重烧创伤后，内毒素等外来抗原可以刺激机体产生大量的细胞因子，这些细胞因子使机体表现出强烈的炎症反应。在促炎因子产生的同时,为了对抗这种强烈的炎症反应，机体产生另一些抑制炎症的细胞因子。 炎症反应的转归将取决于这两类因子的平衡,任何一方的过度优势均可以造成炎症失控,而成为多器官功能障碍综合征(MODS)的基础[1]。许多临床研究发现：在严重烧伤后，患者迅速进入一种增随强烈的全身炎性反应的“免疫麻痹”状态[2]。在这种状态下，单纯抗炎治疗不能降低烧伤脓毒症患者的死亡率[3]，而通过有效的免疫调理，使处于"麻痹"状态的免疫细胞恢复才是纠正烧伤后免疫紊乱的关键。

　　临床研究证实，重症患者单核细胞表面HLADR的表达率高低与预后有明确的关系[4，5]。CD14+细胞表面HLADR的表达率和血浆内炎性细胞因子的水平可以用来衡量免疫调理的效果。人类单核细胞表面HLADR的表达率是目前判断是否存在免疫麻痹的金标准，即当CD14+细胞表面HLADR<30%时，认为存在免疫麻痹[6]。人工合成胸腺肽纯度高、安全、无明显毒副作用，可通过调节T细胞、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞免疫;增强外周血γ干扰素的产生;增强巨噬细胞的吞噬功能等途径参与免疫的调节[8]，在一些免疫疾病的治疗中有明确疗效[7]。

　　本研究对比了特重烧伤后应用胸腺肽与未用胸腺肽的患者血浆TNFα、INFγ和单核细胞表面HLADR的表达率的变化，发现应用胸腺肽的患者血浆细胞因子TNFα较未用胸腺肽治疗的患者略低，但差异不显著。这可能与样本量较小有关，但也不能排除胸腺肽通过对免疫细胞的调理作用从而间接的减轻了过度炎性反应的可能。在正常情况下，血中内源性IFNγ量很少，在内毒素的刺激下，内源性IFNγ的释放，参与免疫调节。但研究中发现严重烧伤后未应用胸腺肽的患者中，IFNγ的水平几乎测不出，提示T细胞处于失能状态;而对于应用了胸腺肽的患者,血浆中IFNγ的水平大幅度升高,在停药后一段时间仍可维持较高水平，提示其在一定程度上使遭受严重的烧伤打击后处于失能状态的T细胞功能得到恢复。在伤后7、14、28天应用胸腺肽的患者单核细胞表面HLADR表达率恢复较未用胸腺肽患者明显，提示胸腺肽可能通过提高IFNγ水平来调节HLADR。

　　严重烧伤患者伤后免疫细胞被激活,机体发生严重的炎症反应;同时，由于反馈性的自我保护机制,免疫细胞又会对免疫刺激的反应性降低处于一种麻痹或无能状态，表现为机体发生过度的全身炎性反应的同时，不能对外来微生物产生有效的免疫应答,而导致严重感染。本研究表明：胸腺肽可以对严重烧伤患者这种紊乱的免疫状态进行有效的调理。

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