TNF-α和MMP-9在格林-巴利综合征发病机制中的作用

　　作者：汪南田,李淮玉,任明山　　作者单位：242000 宣州市人民医院神经内科 　230001 合肥 安徽省立医院神经内科(李淮玉 任明山)

　　【摘要】目的 探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在格林-巴利综合征(GBS)发病机制中的作用。 方法 (1)采用ELISA双夹心法检测24例GBS患者和19例健康人TNF-α和MMP-9血浆浓度。(2)用免疫组化方法分别检测GBS组(7例)和对照组(7例具有遗传性神经病患者)腓肠神经中TNF-α和MMP-9的表达。 结果 (1)TNF-α和MMP-9浓度在GBS组明显高于对照组(均P<0.001)，且其浓度与临床分级间有显著相关关系(r值分别为0.712和0.724)。(2)在GBS腓肠神经中，MMP-9表达于血管内皮细胞、T淋巴细胞和神经纤维上;TNF-α表达于神经纤维上。 结论 在GBS中 ，MMP-9可能对白细胞渗出、血-神经屏障(BNB)和髓鞘结构的破坏起重要作用，TNF-α可能在免疫介导的脱髓鞘和轴索损伤中起重要作用。

　　【关键词】 格林-巴利综合征,腓肠神经,肿瘤坏死因子-α;基质金属蛋白酶-9

　　[Abstract] Objective To explore the role of tumor necrosis factor alpha (TNF-α)and matrix metalloproteinase-9 ( MMP-9) in the pathogenesis of Guillain-Barre syndrome (GBS). Methods (1) The serum TNF-a and MMP-9 concentrations were measured by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 24 patients with GBS and control(19 cases).(2) we detected the expression of TNF-αand MMP-9 in sural nerve from the patients (7 cases) with GBS and the patients (7 cases) with hereditary neuropathies using immunohistochemistry. Resealts (1) The concentrations of TNF-αand MMP-9 were raised in GBS group than control group (all p<0.001). Elevated serum concentrations of TNF-αand MMP-9 showed a positive correlation with the disease severity in patients with GBS (r=0.712 and r=0.724).(2) Immunohisto- chemical findings of seven sural nerves biopsies of patients with GBS disclosed an immunoreactivity of MMP-9 on endothelial cells ，T lymphocytes and nerve fibers ,and TNF-α on nerve fibers. Conclusion Our findings imply an important role for MMP-9 in transmigration of inflammatory cells，the degradation of blood-nerve barrier，and demyelination of peripheral nerve,and for TNF-αin the cascade of events leading to immune-mediated demyelination and axonal damage in GBS.

　　[Key words] Guillain-Barre syndrome; Sural nerve; Tumor necrosis factor alpha; Matrix metalloproteinase-9

　　急性炎性脱髓鞘性多发性神经病又称格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome ，GBS)，其基本的病理改变是周围神经脱髓鞘和炎症细胞浸润，它的发病机制迄今尚不完全清楚。研究发现，给周围神经注射TNF-α可导致明显的脱髓鞘和轴索损害[1]。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)能水解基底膜和其他基质成分，促进炎症细胞从血液进入神经组织中。Sharshar等[2]观察到MMP-9与GBS患者的神经电生理异常有关。Hughes等[3]用BB-1101(一种广谱MMP抑制剂)能减轻实验性自身免疫性神经炎(EAN)症状发作时疾病的严重程度。上述研究表明TNF-α和MMP-9可能参与GBS发病机制。本研究对24例GBS患者血清TNF-α和MMP-9水平进行检测，并用免疫组化方法检测它们在患者腓肠神经中的表达，探讨其在GBS发病机制中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 将24例GBS患者作为血浆TNF-α和MMP-9的检测对象，其中，男性13例，女性11例，年龄19~58岁，平均(36.3±12.2)岁。从发病至采血时间均在发病2周内，血样本采集前除有3例(3/24)曾使用过激素(3例均使用地塞米松10mg•d-1，静脉滴注，分别为3、5、10天)外，其余病例均末曾使用影响免疫功能的药物。并根据病情轻重参照Hughes等[5]临床分级。正常对照组为19例门诊健康体检者，其中男性11例，女性8例，年龄20~54岁，平均(39.2±11.2)岁。此外，收集7例GBS患者腓肠神经活检蜡块，其年龄为27~56岁，平均(38.6±13.0)岁;男女之比4:3;发病到腓肠神经活检的时间 7~13天平均(9.6±2.2)天。全部病例均未曾使用过皮质类固醇激素、进行过血浆交换和免疫球蛋白治疗。对照组共7例，其中遗传性运动感觉性神经病 I型2例，遗传性运动感觉性神经病 II型2例，压迫易感性遗传性神经病3例。对照组年龄25~74岁平均(43.3±17.1)岁;男女之比5:2。全部GBS病例均符合中华神经精神科杂志编委会1993年10月制定的诊断标准[4]。排除标准：排除包括发热、休克、明显的感染(根据临床表现或白细胞计数高于20×109L-1来判断)病例。

　　1.2 实验方法及试剂 TNF-α和MMP-9血浆浓度检测：抽取受检者静脉血5 mL，肝素抗凝，离心后取血浆，于-20℃保存备测。采用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α和MMP-9血浆浓度。免疫组化染色：2组腓肠神经活检标本均已经过4%甲醛液固定，脱水、石蜡包埋。将蜡块进行切片，切片厚为3 μm。为确定T细胞和巨噬细胞的分布用CD3和CD68标记炎症细胞。采用免疫组化二步法检测，并用PBS代替一抗作为阴性对照，用阳性切片(武汉博士德生物工程有限公司提供)作为阳性对照。TNF-α和MMP-9血浆浓度检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫组化检测试剂：抗MMP-9和TNF-α兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。CD3和CD68鼠抗人单克隆抗体和PV-6000通用型二步法检测试剂盒及DAB显色试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。操作严格按说明书进行。

　　1.3 统计学处理及免疫组化结果判定 应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量数据均表示为x±s，两样本均数比较采用t检验，病情轻重临床分级与血浆TNF-α和MMP-9浓度之间相关性采用Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。免疫组化结果判定： 阳性着色为棕黄色。细胞的阳性判定：CD3是细胞膜着色为阳性，CD68、MMP-9细胞质着色为阳性。血管阳性判定：内皮细胞胞浆着棕黄色为阳性。

　　2 结果

　　2.1 GBS组与正常对照组血浆TNF-α和MMP-9浓度(x±s)测定比较 结果显示，TNF-α和MMP-9浓度在GBS组明显高于正常对照组(表1)。表1 GBS组与对照组血浆TNF-α和MMP-9浓度比较

　　2.2 GBS患者临床分级与血浆TNF-α和MMP-9浓度的关系(见表2) 结果显示临床分级为1~2级的患者血浆TNF-α和MMP-9浓度接近正常或稍高于正常，而4~5级者显著增高。患者血浆TNF-α和MMP-9浓度与临床分级两变量间直线相关分析发现，两者间有显著相关关系(r值分别为0.712和0.724，P<0.05)。　表2 GBS临床分级与血浆TNF-α和MMP-9浓度

　　2.3 MMP-9和TNF-α的表达 在GBS腓肠神经中，MMP-9有显著的阳性表达(见图A、B、C)。显微镜观察可见MMP-9表达于神经外膜、神经束膜及神经内膜的血管内皮细胞上和神经纤维上，此外，还可见MMP-9表达于神经外膜中血管周围的炎症细胞上，而在对照组未见表达。根据对连续切片观察所见，细胞的形态及分布相似于CD3+ 细胞，表明是T淋巴细胞。在GBS腓肠神经中，可见TNF-α表达于巨噬细胞、髓鞘和轴索上(见图D)，对照组腓肠神经未见TNF-α表达(图E)。

　　3 讨论

　　Sharshar [2]研究21例GBS患者的血清MMP-9水平与电生理异常的关系时发现血清MMP-9水平与全面的神经电生理异常(包括F波潜伏期延长、CMAP幅度减少、神经传导速度减慢)有关。而Hughes [3]用BB-1101(一种广谱MMP抑制剂)能减轻实验性自身免疫性神经炎(GBS动物模型)发作时的症状。本研究结果显示：GBS患者血清MMP-9水平高于正常对照组，且其浓度与GBS疾病的严重性呈正相关，可见MMP-9在GBS发病机制中起关键作用。

　　本免疫组化结果显示：MMP-9表达于神经外膜、神经束膜及神经内膜的血管内皮细胞上，表达于神经外膜中血管周围的炎症细胞(T细胞)及神经纤维上，而对照组未见明显表达，表明在GBS腓肠神经中MMP-9表达均是上调的。

　　正常情况下，在周围神经与血液之间存在类似于血-脑屏障的血-神经屏障， 完整的血-神经屏障能够阻止淋巴细胞和抗体等进入周围神经实质内，从而保护了周围神经。基底膜是血-神经屏障的重要结构，主要由细胞外基质蛋白(如IV型胶原、层粘蛋白、纤连蛋白等)构成，以IV型胶原和层粘蛋白最为重要。MMP-9能降解IV型胶原。本研究显示MMP-9在GBS腓肠神经中表达是明显增加的， MMP-9可降解IV型胶原，从而造成基底膜破坏，导致血-神经屏障完整性的破坏，使炎症细胞、抗体等易于到达周围神经造成神经损伤。本研究中，MMP-9在GBS腓肠神经中的T淋巴细胞有显著的阳性表达，表明在GBS患者中T淋巴细胞是MMP-9的来源之一，当活化的T淋巴细胞接触血管壁时，其产生的MMP-9将能降解血管基底膜中IV型胶原，导致血-神经屏障破坏，这有利于T淋巴细胞从血管壁渗出。此外，免疫组化发现MMP-9表达在GBS神经纤维的髓鞘上。MMP-9可降解Schwann细胞基膜(其中含有IV型胶原)和髓鞘碱性蛋白(一种周围和中枢神经主要的髓鞘成分)[6]。MMP-9在GBS神经纤维的髓鞘上表达表明MMP-9可能与GBS脱髓鞘有关。Sharshar 等[2]研究发现在GBS患者血清中MMP-9在脱髓鞘组明显高于非脱髓鞘组，这也支持了MMP-9与GBS周围神经脱髓鞘有关。总之，MMP-9可能对白细胞渗出、血-神经屏障的破坏、髓鞘结构的破坏等GBS发病环节起重要作用。

　　本研究还显示：GBS患者血浆TNF-α水平高于正常对照组，且其浓度与GBS疾病的严重性呈正相关，这与Radhakrishnan等[7]研究结果相似。已有研究表明TNF-α对内皮细胞、髓鞘以及轴索有毒性作用[1]。循环中的TNF-α浓度升高与远端混合肌肉动作电位波幅下降之间的关系也表明这种细胞因子对轴索的影响[8]。TNF-α可以由对Schwann细胞膜的直接作用诱导脱髓鞘，或通过间接地干扰轴索代谢。本研究显示了TNF-α在GBS患者神经纤维上的阳性表达，在周围神经中抗TNF-α的免疫反应在Schwann细胞和轴索上被观察到，这表明TNF-α可能是免疫介导性髓鞘脱失和轴索损伤的重要的细胞因子。

　　TNF-α与MMP-9之间在GBS中可能具有复杂的相互作用。MMP-9可诱导与膜结合的TNF-α释放而发挥其生物活性作用[9]，而与细胞外粘附分子结合的TNF-α能刺激单核细胞表达MMP-9[10]。TNF-α与MMP-9之间的相互作用可能对GBS炎症反应起协同性作用。

　　【参考文献】

　　[1] Redford EJ, Hall SM,Smith KJ.Vascular changes and demyelination induced by the intraneural injection of tumour necrosis factor.Brain , 1995,118: 869- 878.

　　[2] Sharshar T, Durand MC, Lefaucheur JP, et al. MMP-9 correlates with electro physiologic abnormalities in Guillain-Barre syndrome.Neurology, 2002, 59(10): 1 649-1 651.

　　[3] Hughes PM, Wells GM, Clements JM, et al. Matrix metalloproteinase expression during experimental autoimmune neuritis. Brain, 1998,121 ( Pt 3):481-494.

　　[4] 中华神经精神科杂志编委会.格林-巴利综合征诊断标准.中华神经精神科杂志,1994, 27 (6)：380.

　　[5] Hughes RAC,Newsom-Davis J,Perkin G.Controlled trial of perdnisolone in acute polyneuropathy .Lancet,1978,2:750-753.

　　[6] Proost P, Van Damme J, Opdenakker G. Leucocyte gelatinase B cleavage releases encephalitogens from human myelin basic protein. Biochem Biophys Res Commun,1993,192:1 175-1 181.

　　[7] Radhakrishnan VV, Sumi MG, Reuben S, et al. Serum tumour necrosis factor-alpha and soluble tumour necrosis factor receptors levels in patients with Guillain- Barre syndrome.Acta Neurol Scand,2004 ,109(1):71-74.

　　[8] Sharief MK, Ingram DA, Swash M. Circulating TNF-α correlates with electro- diagnostic abnormalities in Guillain-Barre syndrome.Ann Neurol ,1997, 42: 68-73.

　　[9] Gearing AJ, Beckett P, Christodoulou M, et al. Processing of tumor necrosis factor-[alpha] by metalloproteinases. Nature,1994,370:555-557.

　　[10] Vaday GG, Hershkoviz R, Rahat MA, et al. Fibronectin-bound TNF-α stimulates monocyte matrix metalloproteinase-9 expression and regulate chemotaxis.J Leuko Biol, 2000 , 68 (11):737-747.