血管束植入联合细胞移植治疗兔股骨头坏死模型的实验研究

　　股骨头缺血性坏死的治疗是一世界性难题。保存股骨头的姑息性治疗方法多种多样，但无论哪种方法其理论依据无非基于以下几点:改变股骨头的负重力线;降低骨内压;促进新骨的形成;改善或重建股骨头的血液循环。实践证明多种方法的联合应用效果要好于单一的方法。组织工程学的兴起，对骨髓基质干细胞及细胞因子研究的不断深人，为股骨头缺血性坏死的治疗提供了一个新的思路。本实验从促进新骨的形成、改善股骨头的血液循环人手，采用血管束植人联合同种异体骨髓基质干细胞移植的方法治疗股骨头缺血性坏死，旨在探索治疗股骨头坏死的一种新方法。　　1材料与方法　　1.1实验动物选用成年新西兰大白兔36只(白求恩国际和平医院实验动物中心提供)，雌雄不限，3,4月龄，体质量2.53.0kg。随机分为A,B,C3组，每组12只，所有动物的双侧股骨头均参加实验。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。　　1.2同种异体骨髓基质干细胞移植前准备穿刺新西兰大白兔骼后上棘，所获骨髓种植于6孔细胞培养板内，加人条件培养液5ml(15%胎牛血清，100U/ml青霉素钠,100U/ml链霉素，10mmol/L日甘油磷酸钠，10}mmol/L地塞米松，50mg/L维生素C)，放人细胞培养箱中培养。培养箱温度370C，含5%COZ,100%饱和湿度。Sd后首次换液，以后每3d换液1次，用0.25%胰蛋白酶及EDTA消化，原孔传代，条件培养液继续培养。细胞传至第3代，胰蛋白酶消化后获取细胞悬液，离心并弃上清，加人适量的细胞冻存液(10%二甲基亚矾，40%FBS,50%DMEM)，调整细胞浓度为0.5x10'/ml，分装到塑料冻存管，每管1.5ml，迅速移人4℃冰箱，20min后移人一20℃冰箱，30min后移人一80℃冰箱过夜，隔日置入一196℃液氮罐中保存。7d后取出冻存管，立即在37℃水浴中解冻，待细胞悬液融化后加人10倍量的DMEM低速离心，弃上清，加15%FBS的条件培养液继续培养。第2天换液，去除死亡细胞及未贴壁的细胞，之后每隔2}3d换液1次。将长满瓶底的第5代骨髓基质干细胞消化离心，用培养液调成4x106/ml细胞悬液，复合于0.4cmx0.3cmx0.2cm的胶原蛋白海绵上。每块海绵含细胞悬液50闪，共20万个细胞，在细胞培养箱中孵育Sh备用。　　1.3模型的制作、细胞移植及血管束的植人脱去双侧下腹部及大腿的毛发，40mg/kg硫喷妥钠做腹腔注射麻醉。取仰卧位，固定四肢，消毒铺巾，髓关节前侧切口，依次切开皮肤、皮下，分离肌肉，切开关节囊，显露股骨头，保护周围组织，以液氮棉团冷冻股骨头8次，约3min}}}。用温生理盐水复温后，从股骨颈前内侧用直径为3.5mm钻头向股骨头内钻人约5mm，穿透股骨头髓线，到达关节软骨下。A组植人胶原蛋白海绵，B组植人复合有同种异体骨髓基质干细胞的胶原蛋白海绵，C组植人复合同种异体骨髓基质干细胞的胶原蛋白海绵，同时植人腹壁浅动、静脉束。C组动物手术时，切口在原基础之上向内上方延伸，切开皮肤、皮下，将腹壁浅动静脉远心端结扎，游离时注意尽量保留血管周围组织，近心端解剖至股动脉分支处，长约5cm。向内下旋转，植人股骨头骨缺损区内，远心端用7-0号无创伤缝合线固定于关节软骨面上。然后将复合同种异体骨髓基质干细胞的胶原蛋白海绵植人骨缺损区，包绕血管束。　　1.4股骨头标本的制作和组织学观察分别于术后孰4,8,12周处死3只动物。所获的股骨头标本分别做组织切片HE染色，采用北航病理图像分析系统对组织切片缺损区新生骨小梁的面积百分比及股骨头冠状截面血管密度进行测算，做统计分析。　　1.5统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，定量资料先进行正态分布检验，对于正态分布资料用成组设计独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1股骨头标本的组织学观察2周标本:各组股骨头关节面稍毛糙，软骨细胞层变薄，头下骨小梁变细，骨陷窝空虚。A组缺损区可见零星成骨细胞，纤维组织充填，在钻孔的边缘形成少量的类骨质及新生骨小梁;B组和C组缺损区有大量的成骨细胞增生，新生骨小梁开始形成，并可见少量的浆细胞和淋巴细胞(图1);C组股骨头缺损区可见原始的毛细血管形成(图2)04周标本:A组股骨头缺损区边缘骨小梁有所增多;;B组股骨头缺损区有骨小梁及类骨质形成，但新生骨小梁及新生毛细血管均较C组稀少;;B组和C组股骨头缺损区的浆细胞和淋巴细胞明显减少，在髓线被破坏的部分可见新生髓板形成。　　8周标本:A组钻孔缺损区出现大量的骨髓组织;;B组股骨头缺损区有大量骨小梁形成，但骨小梁幼稚、稀疏、排列紊乱(图3);C组股骨头缺损区新生骨小梁板层状或编织状，毛细血管丰富，可见红细胞、血小板等结构(图4)，但修复尚不均匀;;B组和C组缺损区浆细胞和淋巴细胞少见。12周标本:A组股骨头缺损区充填大量骨髓组织及部分纤维组织，仅缺损区边缘形成少量的骨小梁及类骨质;;B组股骨头缺损区可见大量细小的骨小梁，排列不规则;C组缺损区骨小梁变宽变粗(图5)，排列规则，可见成熟的骨小梁及新生骨髓(图6).　　2.2股骨头冠状截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺损区所占的面积比结果见表laB,C两组股骨头冠状截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺损区所占的面积比，2周时差异无统计学意义;4,8,12周C组股骨头冠状截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺损区所占的面积比均比同时期B组大。　　3讨论　　3.1骨髓基质干细胞异体移植的可行性近年来　　关于骨髓基质干细胞移植的实验研究虽然有了较大进展，但细胞移植实验多局限于自体移植方面〔2一3〕。在异体移植方面的研究较少，而在异体移植的研究中又多是采用新生兔的骨髓基质干细胞。尽管自体细胞移植不存在免疫排斥反应方面的问题，但是自体移植须开辟第二手术野，运作周期也比较长，难于在临床上推广应用。因而从长远看，异体细胞移植更具应用前景。　　本实验研究了成年兔骨髓基质千细胞异体移植，取得了比较理想的结果:复合有同种异体骨髓基质干细胞的胶原蛋白海绵植人股骨头坏死骨缺损区后，2周时可见少量淋巴细胞和浆细胞存在，4周时明显减少，以后连续观察至12周炎性细胞消失;植人的同种异体骨髓基质干细胞存活且具有较强的成骨能力，2周时即有新生骨小梁形成，移植物未被排斥。本实验初步证明了经过多次消化传代，冷冻复苏的同种异体成年兔骨髓基质干细胞可以用作移植，以修复股骨头坏死骨缺损。　　异体骨髓基质干细胞之所以能够存活而不被排斥，在于细胞移植不同于组织及器官移植，产生免疫反应的成分仅为细胞本身，主要是位于细胞膜表面的MHCI,II类抗原，体外培养的细胞是一较为纯化的细胞系，经多次胰酶消化、传代，可使部分膜表面抗原受体丢失，从而降低其免疫原性;同时，超低温保存细胞可使细胞的免疫反应性降低。另外，骨髓基质成骨细胞分泌的多种生长调节因子对免疫细胞亦有调节作用。加上创伤刺激了TGF-p等活性因子的分泌，这些活性因子也具有抑制免疫排斥反应的作用。　　3.2血管束植人在股骨头坏死修复中的作用血运重建是组织再生的基础，要获得组织工程化组织必须保证植人体内的种子细胞尤其是材料内部的种子细胞能够获得及时充分的营养。这又有赖于充足的血液供应和细胞与材料复合物内血供重建的程度和速度。因此进行细胞和材料复合物内血供的重建就成为组织工程由基础向临床应用的关键环节。　　血管束植人的方法操作简单而有效，同时血管束植人也是治疗股骨头坏死的一种传统方法。胡优威等5〕应用旋股外侧血管束植人法治疗成人股骨头无菌性坏死;何伟等[L67应用旋股外侧动静脉的升支、横支组成多条血管束，经“V”形骨隧道植入股骨头治疗股骨头无菌性坏死均取得了满意效果。血管束植人治疗股骨头坏死虽然有效，但单纯血管束植人所提供的成骨效应因素有限，难以提供股骨头修复所需的机械支撑因素，不能有效预防股骨头塌陷。更多的学者倾向于血管束联合其他方法共同治疗股骨头坏死，比如血管束联合骨移植等。　　在植人血管束的选择上，临床多选用旋股外侧动静脉或旋骼深血管。在动物实验研究中，田军等采用股深动脉植人加游离骨膜治疗兔股骨头坏死模型，取得满意效果。本实验选用了兔腹壁浅动静脉作为移植的血管束植人股骨头坏死骨缺损中，同样取得了理想的结果。从组织切片看，2周时C组和B组在骨小梁的面积百分比上差异无统计学意义，但C组股骨头标本缺损区可见原始毛细血管形成。从4周标本开始，C组的标本可见大量的毛细血管，而未植人血管束组与同期血管束植人组的标本相比，无论是新生的毛细血管还是新生的骨小梁，都要稀少。采用北航病理图像分析系统对C,B两组标本的冠状截面血管密度及新生骨小梁占缺损区的面积百分比进行测算，并进一步做统计分析，结果在4,8,12周时C组的冠状截面血管密度及新生骨小梁的面积比同期B组的都要大。　　分析出现以上差异的原因可能有以下几点:一是股骨头坏死骨缺损区植人腹壁浅动静脉束后，新生血管以出芽的方式呈放射性生长，形成新生血管网，改善了股骨头的血液循环，为所移植的细胞提供营养，促进了新骨的形成;二是丰富的毛细血管带人的有活性的成骨效应细胞有利于死骨吸收和新骨形成，血管束周围结蒂组织带进的部分胶原纤维也参与成骨活动。从而最大限度地起到了促进新骨形成，修复股骨头，防止塌陷的作用。　　综上所述，经过冷冻复苏、多次消化传代、并向成骨细胞定向诱导的同种异体成年兔骨髓基质干细胞免疫排斥力弱，能在液氮冷冻股骨头坏死骨缺损区形成新生骨小梁，可用作异体移植。植人股骨头坏死骨缺损区的腹壁浅动静脉束可以有效改善股骨头血运，同时给所移植的细胞提供营养，促进新生骨小梁的形成。定向诱导的同种异体骨髓基质干细胞与腹壁浅动静脉束相辅相成，它们的联合应用可以快速、有效地修复股骨头坏死骨缺损。　　参考文献　　王江泳,王保芝,崔慧先. 改良液氮冷冻法制备家兔股骨头坏死模型的实验研究[J].河北医科大学学报,2008,(01):5-8.doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2008.01.002.　　Yan Z,Hang D,Guo C. 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