骨细胞分离培养及其与成骨细胞鉴别比较的实验研究

　　骨细胞和成骨细胞是骨组织细胞的重要组成部分。骨细胞由成骨细胞分化而来，占骨组织细胞总量的95%，是矿化的骨基质中惟一的一种细胞，也是骨组织中数量最多、寿命最长的细胞，其对机械应力最为敏感，是骨组织中机械应力的主要感受器。成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用，是骨组织中机械应力的主要效应细胞。相对成骨细胞而言，由于骨细胞的位置特殊，使可供在体外进行研究的骨细胞的获得比较困难甲;而成骨细胞体外培养方法开始于20世纪60年代，目前这种方法已发展成为一种重要的且较为成熟的实验方法。随着新技术方法的应用，对成骨细胞系终末分化的细胞研究逐渐深人，人们由此对骨细胞的兴趣大增。近年来的研究发现，骨细胞不仅能影响局部骨转换活性，而且对全身矿物质的体内平衡也有多种功能，因此，对骨细胞的研究可以为代谢性骨病的治疗提供新的途径:。然而由于目前可供体外实验研究的骨细胞系较少，有效稳定的骨细胞分离方法尚不十分明确，研究者多选择较易获得的成骨细胞进行实验，而忽略了对骨组织中含量最多的骨细胞进行探究。为此，笔者尝试利用序列酶消化法从3d龄SD乳鼠骨骼中分离培养骨细胞，通过其与实验室常规培养的成骨细胞进行形态学比较，并结合碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定和骨钙素染色等实验手段，对分离的骨细胞进行鉴定。从而探索建立较为稳定的区别于成骨细胞培养的实验室骨细胞分离培养方法，为进一步开展实验研究提供手段。　　1 材料与方法　　实验动物3d龄SD乳鼠6只，清洁级。由浙江中医药大学动物实验中心提供，分别用于骨细胞和成骨细胞分离培养。　　1.2主要器材二氧化碳恒温培养箱(德国Ther-m。电子公司)，双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜及显微拍摄系统(德国Leica公司)，BioTek800酶标仪(美国BioTek公司),6孔培养板，24孔培养板，96孔培养板(美国Corning公司)。　　1.3试剂RPMI1640含双抗培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司)，I型胶原酶(达文生物有限公司),PBS缓释液(吉诺生物医药技术有限公司)，0.02%EDTA(吉诺生物医药技术有限公司)、D-Hanks溶液(吉诺生物医药技术有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物公司)，碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成生物公司)，小牛血清蛋白BSA(北京元亨金马生物技术开发有限公司)，RabbitAnti-BGP博士德生物工程有限公司)，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG,DAB(A/B/C)(中杉金桥生物制品有限公司)。　　1.4干预措施　　1.4.1骨细胞序列消化分离、培养及传代主要参考GU4''的培养方法改进后步骤如下:①在无菌状态下取得3只3d龄SD乳鼠骨组织(长骨和颅骨)，长骨在去掉干髓端后纵向剖开骨髓腔刮除骨髓，将骨片放人70%的酒精，巧s取出放人PBS缓释液内备用;②在PBS中清洗骨组织，尽可能剔除周围软组织和骨膜，此过程重复3}4次;③将骨组织剪成1mmx3mm骨片，放人试验前临时配制的胶原酶溶液的培养皿中(I型胶原酶溶人PBS缓冲剂中，1mg/ml)，置于37℃温箱20min，然后去掉上清液，用D-Hanks溶液清洗骨片2次，这个过程共重复4次;④另取新的培养皿，将骨片放人0.02%EDTA溶液(含0.1%小牛血清白蛋白)中，置于37℃温箱20min，然后去掉上清液，用D-Hanks溶液清洗骨片2次;⑤将骨片放入试验前临时配制的胶原酶溶液}I型胶原酶溶人PBS缓冲剂中，1mg/ml)，置于37℃温箱20min，然后去掉上清液，用D-Hanks溶液清洗骨片2次;⑥取一新的培养皿，将骨片放人0.02%EDTA溶液(含0.1%小牛血清白蛋白)，置于37℃温箱20min，然后去掉上清液，用D-Hanks溶液清洗骨片2次，并将骨片剪成1mmxlmm小块;⑦将骨片放人装有试验前临时配制的胶原酶溶液(I型胶原酶溶人细胞分离缓冲剂中，1mg/ml的试管中，置于37℃恒温水浴锅40min;⑧反复振荡用力吸吹骨片，收集上清液，离心(1000r/min,10min),然后去掉上清液，向试管内加入1640培养液(含有10%胎牛血清)，吹打培养液，吸取培养液，显微镜下用计数板计数，然后接种于6孔培养板中，置于细胞培养箱(370C,5%COZ)培养，24h左右换液1次，以后2}3d换液1次，至细胞长成融合状态进行细胞传代。　　1.4.2成骨骨细胞序列消化分离、培养及传代取3d龄SD乳鼠3只，颈椎脱臼后，75%乙醇浸泡10min。揭去头顶皮肤，切下头盖骨置于PBS液内，清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS液清洗2次后，将清洗至发白的头盖骨剪成1mmxlmm小片。将骨片移人5ml,0.25%胰蛋白酶溶液内，37℃下预消化20min，以清除纤维组织。将骨片移人另一含5mL0.1%I型胶原酶溶液中，37℃振荡消化分离细胞60min，收集消化液。将收集的消化液在1000r/min下离心10min，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液。剩余骨片重复用I型胶原酶震荡消化、离心，制成细胞悬液，将两次细胞悬液混匀、计数，置人6孔培养板中，置于370C5%CO:培养箱中培养。24h左右换液1次，以后2}3d换液1次，至细胞长成融合状态进行细胞传代。　　1.5观察项目与方法　　1.5.1骨细胞、成骨细胞细胞形态观察培养24h细胞贴壁后，可将盛有骨细胞和成骨细胞的6孔培养板至于倒置荧光显微镜下进行观察、拍照。　　1.5.2骨细胞、成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色采用重氮盐法(改良Kaplow氏法)行碱性磷酸酶染色，步骤如下:①固定:抽吸6孔培养板中一孔或多孔的培养液，用PBS缓冲剂清洗2次，待干燥后，滴加固定液固定3min;②加底物应用液:固定样本后，滴加底物运用液，将培养板放人湿盒(含双蒸水纱布的容器)避光370C孵育巧min，用双蒸水水洗;③复染:趁湿用复染液复染(苏木素或甲基绿)3min左右，水洗，显微镜下观察。　　1.5.3骨细胞、成骨细胞骨钙素(BGP)染色采用免疫细胞化学法，一抗为兔抗骨钙素抗体(RabbitAnti-BGP)，二抗为碱性磷酸酶标记山羊抗兔I}G,按照DAB试剂盒要求操作，步骤如下:①吸弃培养液，PBS快速冲洗数次，95%乙醇固定，室温30min,蒸馏水洗3次，每次5min;②加人0.1%Triton破膜，室温10min,PBS洗3次;③加人1%BSA封闭，室温30min;④加人一抗(1:200)，室温孵育120min,PBS洗3次，每次5min;⑤加人二抗(1:200)，室温孵育90min,PBS洗3次每次5min;⑥将DAB浓缩显色液稀释后，滴加显色5一10min,PBS洗3次;⑦待干燥后显微镜下观察。　　1.5.4骨细胞、成骨细胞碱性磷酸酶(AKP)测定将两种细胞传代，混悬液稀释，计数均为2x105个/ml,将混悬液接种于24孔培养板，每孔接种600闪，36h细胞完全贴壁后按试剂盒操作说明测定，方法如下:在96孔酶标板上分测定孔、标准孔、空白孔，测定孔加人各组细胞上清液，每孔30闪，标准孔加人浓度为0.02mg/ml酚标准应用液30闪，空白孔加人双蒸水(培养液差异显著，应考虑取空白培养液替代)30}l。每孔继续加人缓冲液50},l，基质液50},1,充分混匀后，将酶标板置于37℃水浴15min，各孔加人显色剂150闪，轻轻振摇孔板均匀，在波长520nm下，酶标仪测定各孔吸光度。测定后计算碱性磷酸酶含量。公式如下:碱性磷酸酶含量(金氏单位)=[(测定孔吸光度一空白孔吸光度)/(标准孔吸光度一空白孔吸光度)]x酚标准品浓度(0.02mg/ml)x100mlx样品测定前稀释倍数。单位定义:100ml液体在37℃与基质作用15min产生1mg酚为1个金氏单位。　　1.6统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行分析，数据以均数士标准差表示，两组间数据的比较采用两样本均数的t检验P<0.05为差异有统计学意义。　　2 结果　　2.1细胞形态学观察镜下观察，骨细胞多呈星状或树枝状，形态偏短偏圆，表面有4个以上的突触与周围细胞相联系(见图1)。成骨细胞多呈梭形，形态偏瘦偏长，表面有2-3个突触与周围细胞相联系(见图2)。　　2.2碱性磷酸酶(ALP)染色骨细胞甲基绿和苏木素分别染色胞浆内无明显咖啡色或红棕色cAKP颗粒，碱性磷酸酶染色阴性(图3-4);成骨细胞甲基绿和苏木素分别染色，胞浆内可见明显咖啡色和红棕色cAKP颗粒，碱性磷酸酶染色阳性(图5-6)。　　2.3骨钙素(BGP)染色骨细胞、成骨细胞骨钙素染色均为阳性，但骨细胞骨钙素染色细胞边界清晰，胞浆呈黄色，较成骨细胞明显(见图7-8)2.4碱性磷酸酶(AKP)测定按相关公式对两组酶标仪读数进行计算，得出ALP活性(金氏单位)值。采用spss18.o统计软件进行分析，成骨细胞(6孔)碱性磷酸酶的活性(0.501510.0473)明显高于骨细胞(0.3341士0.0341)，差异具有统计学意义(t=7.032,P<0.01)。　　3讨论　　3.1骨细胞和成骨细胞形态学上的差异在成骨细胞向骨细胞的分化过程中，细胞的体积不断减小，成熟的骨细胞体积减少70%，骨细胞丢失了部分细胞器但却获得了很多长突触，这些含有细胞浆的突触将骨细胞与其他骨细胞、成骨细胞和破骨细胞联系在一起，并成为骨细胞在形态学方面一个显著的特征。从本实验结果可以看到，骨细胞较成骨细胞体积小、突触多，这种形态有利于增强骨细胞的感应性，从而使它更好地发挥感应细胞的作用，与有学者指出的，占骨组织细胞总量为95%的骨细胞，是对机械应力最敏感的细胞，是骨组织中机械应力的主要感受器，它可以将机械应力转化为生化信号，在骨的功能性适应变化启动之前将力学信号整合加工，并通过缝隙连接和旁分泌的形式将相应的电、化学信号传给效应细胞的理论f3相吻合。　　3.2骨细胞和成骨细胞碱性磷酸酶表达差异碱性磷酸酶(ALP)主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，促进细胞成熟、钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标叫。本实验发现骨细胞碱性磷酸酶的表达与活性要低于成骨细胞，该实验结果与Kato}lz',Gu等实验结果相符，证明实验室条件下，确实能从骨组织中分离出与成骨细胞在碱性磷酸酶表达上存在显著差异的骨细胞。　　3.3骨细胞和成骨细胞骨钙素染色差异骨代谢生化指标中的骨钙素(BGP)是骨形成的特异性标志物，骨钙素是骨组织中丰富的非胶原蛋白，其主要功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常轻磷灰石结晶的形成，抑制软骨的矿化速率，维持骨量平衡，参与骨骼重塑洲。Kat等实验结果表明成骨细胞骨钙素染色阴性，骨细胞骨钙素染色为阳性;而Gu等7一认为，骨细胞和成骨细胞骨钙素染色皆为阳性。　　本实验证实成骨细胞骨钙素染色虽为阳性，但较骨细胞更不明显，说明骨细胞骨钙素含量要高于成骨细胞，其原因有待进一步研究，可能与细胞基因表达的差异、细胞的来源不同和染色方法差异有关。　　总之，由于骨细胞培养和鉴别的技术难题，很多研究者在骨组织科学的研究中会选择拥有成熟细胞培养鉴定方法的成骨细胞进行实验研究，而忽略了骨细胞与成骨细胞很多不同的生物学特性给研究带来的不同结果。同时，成骨细胞具备向骨细胞分化的能力，而骨细胞在应答机械应力信号时树突伸长，并释放可溶性因子(如PGE2,ATP和NO)，向效应细胞发送信号，调节成骨细胞的功能，很多围绕成骨细胞的研究中，由于没有考虑数目为成骨细胞10倍之多的骨细胞存在的干扰问题，故也不能准确说明问题。本实验证明，在实验室条件下能培养出骨细胞，且该类细胞和成骨细胞有明显区别，将为进一步深人研究骨细胞、成骨细胞的相互关系，以及它们特有的生物特性提供良好基础。　　参考文献　　Neve A,Corrado A,Cantatore FP. Osteocytes:central conductors of bone biology in normal and pathological conditions[J].Acta Physiologica,2012,(03):317-330.　　Lu XL,Huo B,Chiang V. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow[J].Journal of Bone and Mineral Research,2012,(03):563-574.　　Bakk AD,Klein-Nulend J. Mechanisms of Osteocyte Mechanotransduction[J].Clin Reviews Bone Mineral Metabolism,2010,(04):163-169.　　谷国良. 骨细胞的功能:生物学研究和机理探讨[J].中华骨质疏松骨矿盐疾病杂志,2009,(01):1-12.doi:10.3969/j.issn.1674-2591.2009.01.001.　　徐杨俊,赵建宁. 体外培养成骨细胞的研究进展[J].中国骨伤,2010,(07):562-565.doi:10.3969/j.issn.1003-0034.2010.07.030.　　Lozupone E,Favia A,Grimaldi A. Effect of intermittent mechanical force on bone tissue in vitro:preliminary results[J].Journal of Bone and Mineral Research,1992,(Suppl 2):S407-S409.　　Gu G,Nars M,Hentunen TA. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro[J].Cell and Tissue Research,2006,(02):263-271.　　吴承亮,肖鲁伟,童培建. 改良大鼠成骨细胞原代培养方法的实验研究[J].浙江中医药大学学报,2006,(05):459-456.doi:10.3969/j.issn.1005-5509.2006.05.004.　　Delgado-Calle J,Sa(n)udo C,Bolado A. DNA methylation contributes to the regulation of sclerostin expression in human osteocytes[J].Journal of Bone and Mineral Research,2012,(04):926-937.　　Rommel G.Bacabac,Jack J.W.A.Van Loon. Stress response by bone cells and implications on microgravity environment[J].Clinical Reviews in Bone and Mineral Metabolism,2010,(04):179-188.