京尼平苷对硝普钠诱导软骨细胞凋亡与细胞周期的影响

　　骨关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节软骨基质降解为特征的退行性关节疾病，软骨细胞过度凋亡在其发病过程中起着重要作用〔‘一。中药桅子是临床上用于治疗OA有明显疗效的复方制剂，其主要成分京尼平营(Geniposide)常用于热病心烦、高热烦躁、湿热黄疽、小便短赤、热淋、血淋、血热出血、痈肿疮毒以及外用治疗扭挫伤痛等一3。本课题组前期研究发现，桅子浸膏可改善兔OA模型组织学评分，减缓关节软骨退变4"京尼平营可调节细胞周期，减少不增殖细胞比例，促进软骨细胞增殖5〕。本研究通过提取正常大鼠膝关节软骨细胞原代培养，传代并鉴定，硝普钠(sodiumnitxoprusside,SNP)诱导建立软骨细胞凋亡模型，采用不同浓度京尼平昔干预后，嘎哇蓝染色(MTT)法检测软骨细胞增殖，流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡率，硝酸还原酶法检测NO含量，进一步探讨京尼平昔治疗OA的机制。　　1材料与方法　　1.1仪器SW-CJ-2A型净化工作台(重庆汇诚空调净化设备制造公司);2001-13型二氧化碳培养箱(上海常思工贸有限公司);IX-700型倒置相差显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(美国Therm。公司);流式细胞分析仪(美国BecjmanCoulte公司)。　　1.2试剂京尼平普(又名桅子昔，上海源叶生物科技有限公司);硝普钠(北京双鹤现代医药技术有限责任公司，批号:H111021635);胎牛血清(杭州四季青);II型胶原酶(美国Sigma公司);硝酸还原酶法NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)。　　1.3实验动物3月龄清洁级健康SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200250g，由华中科技大学同济医学院提供，合格证号SCXK2004-0007。实验过程中动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》6一01.4分组选用第且代软骨细胞种植于25cm2培养瓶中，待细胞贴壁后，用不含血清的DMEM培养基“饥饿”培养24h，使细胞同步化。分为空白组(10%DMEM培养基培养)，模型组(1.5mmol/LSNP+10%DMEM培养基培养)，50N,g/ml京尼平昔干预组(1.5mmol/LSNP+50N.,g/ml京尼平昔+10%DMEM培养基培养),100}.,g/ml京尼平昔干预组(1.5mmol/LSNP+100}.,g/ml京尼平昔+10%DMEM培养基培养)，200N.,g/ml京尼平营干预组((1.5mmol/LSNP+200协g/ml京尼平普十10%DMEM培养基培养)。　　1.5软骨细胞的分离、培养与传代按参考文献分离培养方法，台盼蓝染色检测所获得的软骨细胞的活性。加人全培养液吹打、混匀，接种于6孔细胞培养板内，置于370C,5%CO:培养箱内进行原代培养。倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况，待细胞贴壁达到85%}90%后传代。　　1.6观察项目与方法　　1.6.1软骨细胞形态学观察及鉴定软骨细胞形态学观察:在倒置显微镜下观察培养的软骨细胞形态学变化并照相。11型胶原免疫细胞化学染色法鉴定原代培养软骨细胞:软骨细胞接种于半径约1.5cm的圆形盖玻片上，盖玻片置于6孔板内，10%DMEM培养基培养24h后，细胞爬片以4%多聚甲醛固定15min，新鲜配制0.5%H20z/甲醇室温处理30min，灭活内源性过氧化物酶。细胞爬片上滴加山羊血清封闭液，室温20min;滴加兔抗鼠型且型胶原单克隆抗体，37℃恒温箱20min,PBS洗涤;滴加羊抗鼠11抗，37℃恒温箱20min,PBS洗涤;滴加SABC,37℃恒温箱20min,PBS充分洗涤后二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，充分水洗;酒精脱水，二甲苯透明，封片，观察，照相。　　1.6.2描绘软骨细胞生长曲线取生长良好的第Ⅱ代软骨细胞制备细胞悬液，接种在24孔板内，每天取3孔细胞计数，持续7d。将所获得的细胞计数值标记在对数坐标纸上，将各点连成曲线即为生长曲线。　　1.6.3嚎哇蓝染色(MTT)法检测软骨细胞增殖取第fl代软骨细胞计数后接种于96孔板中，每孔(23)x103个细胞，每孔加人100},l细胞悬液，培养24h后按分组相应浓度药物处理。每个浓度设置3个复孔，重复3次。分别在2448,72h3个时间点加人MTT10p,1(5g/L)，培养4h后弃上清，每孔加人150p,1二甲基亚飒(DMSO)，振荡10min至结晶溶解。空白对照调零，后于酶标仪测定490nm波长吸光度值。　　1.6.4流式细胞仪分析细胞周期将培养的待测　　细胞置于1.5mlEP管中，PBS漂洗2次，1000r/min离心5min。弃上清，加人预冷的无水乙醇1ml快速混匀，固定细胞(乙醇终浓度为60%}70%)。弃固定液，PBS漂洗2次，1000r/min离心5min。弃上清，加人适量打孔液(0.1%TriTon+RNA酶)转人流式测定管中，加人90闪DNA荧光染料(PI)，室温下避光染色30min,300目尼龙膜过滤，于流式细胞仪测定，分析细胞周期。　　1.6.5流式细胞分析法检测软骨细胞凋亡胰酶消化细胞收集于离心管中，40C,12000r/min离心成细胞团块，按AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书操作，流式细胞仪分析检测。　　1.6.6硝酸还原酶法检测培养液中NO含量收集各组培养液，按试剂盒说明书检测培养液中NO含量1.7统计一学处理动物及细胞分组均随机取样，每个样本3次重复实验。实验数据应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，定量资料以均数土标准差(x1s)表示，采用方差分析，相关性分析采用Spear-man相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1原代培养软骨细胞形态及鉴定HE染色显示第fl代软骨细胞呈星形、多边形，触角明显，胞浆丰富，胞核清晰，可见1}2个核仁，与倒置显微镜下所见细胞形态吻合。且型胶原免疫细胞化检测显示软骨细胞胞浆及细胞外基质被染成棕黄色，表明培养的原代软骨细胞具有软骨细胞特征(图1)a2.2软骨细胞生长曲线软骨细胞生长呈“S”形曲线，第11代软骨细胞在1}2d生长缓慢，处于潜伏生长期，3}5d为快速增殖期，5}6d增值趋于平缓，6-7d增值基本停滞，软骨细胞倍增时间(DT)约在第4天(图2)。　　2.3京尼平昔对SNP诱导软骨细胞凋亡细胞增殖的影响结果见表1oMTT比色显示:与对照组比较，SNP可促进软骨细胞凋亡，其OD值在培养的不同时期均低于空白组;而高中低浓度京尼平昔干预1.5mmol/LSNP诱导软骨细胞凋亡后可促进细胞增殖，不同浓度干预组在培养不同时期的OD值均高于模型组。　　2.4京尼平普对SNP诱导软骨细胞凋亡细胞周期的影响与模型组比较，不同浓度京尼平营干预组细胞处于GO/G1期百分比减少，S及G2/M期细胞百分比增加，说明京尼平营可以调节软骨细胞周期，增加增殖期细胞比例，促进软骨细胞增殖(见表1)a2.5京尼平普对SNP诱导软骨细胞凋亡及培养液中NO含量的影响与空白组比较，模型组细胞凋亡率增高，同时培养液中NO含量增高，说明NO含量增高可能是导致软骨细胞凋亡增加的关键因素之一。与模型组比较，不同浓度京尼平昔干预组的细胞凋亡率降低，培养液中NO含量减少。Spearman相关性分析显示:NO含量与软骨细胞凋亡率呈正相关(r=0.917,P<0.01)，说明京尼平昔可能是通过降低培养液中NO含量从而减少软骨细胞凋亡(见表1)03讨论OA是一种常见的慢性退行性关节病变，发病机制尚不清楚，目前认为OA病理学特征是关节软骨损伤，而关节软骨重要成分是软骨细胞，因此研究OA发病机制应从软骨细胞着手，防治OA应以延缓甚至阻断软骨退行性改变，保护软骨细胞为目标。　　OA在中医中属于“痹证”、“骨痹”范畴，中医药治疗骨关节炎有着悠久的历史，因其效果显著、不良反应小、适合长期治疗而独具优势。中药桅子是临床上用于治疗OA有明显疗效的复方制剂，其重要成分京尼平昔常用于热病心烦、高热烦躁、湿热黄疽、小便短赤、热淋、血淋、血热出血、痈肿疮毒，以及外用治疗扭挫伤痛等。在前期研究4-5〕的基础上，本研究从京尼平昔对软骨细胞凋亡影响的角度进一步探讨其治疗机制。　　在OA病变中过程中有软骨细胞凋亡的特征性　　形态，如染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等，软骨细胞过度凋亡已被公认为关节软骨退行性改变的病理因素之一8-9]。用NO供体硝普钠(SNP)诱导建立软骨细胞凋亡模型已成为一种常用的实验手段io-oSNP诱导细胞凋亡可能存在以下关系:低浓度时抑制细胞凋亡，高浓度时引起细胞凋亡，过高浓度则导致细胞坏死。　　本研究结果表明，SNP诱导软骨细胞凋亡后，细胞凋亡率明显增高，与文献报道一致。京尼平普可促进软骨细胞增殖，与本课题组前期研究结果吻合。　　本研究表明京尼平普可调节软骨细胞周期，促进软骨细胞增殖，降低软骨细胞凋亡率及NO含量。京尼平昔可能是通过减少NO含量抑制软骨细胞凋亡，这可能是京尼平昔治疗OA的重要机制之一。本研究初步揭示了京尼平普抑制软骨细胞凋亡、调节细胞周期的作用，至于如何通过相关信号转导途径实现则需进一步研究。　　参考文献　　Kim DY,Taylor HW,Moore RM. 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