去蛋白脱钙皮质骨基质微颗粒用于骨髓基质干细胞体外培养的相关研究

随着组织工程学理念的深人发展,利用支架材料、种子细胞及生物活性成分构建组织工程学替代材料的临床及科研思路也不断深入。种子细胞的选择以骨髓基质干细胞(BMSCs)较为常见,而在对该细胞的体外扩增过程中,传统的平板培养方式效率较低,很难满足细胞在组织工程构建时种植数目的要求,且存在细胞老化、代次过高等不足;利用微载体在动态悬浮条件下进行干细胞快速高效扩增是目前国际上较为推广的细胞体外培养方式[2],但现存使用较为广泛的微载体多为不可分解的人工合成材料,导致其不能直接作为种子细胞的直接移植载体植入体内[3]。而种子细胞在组织工程学构建时需经过反复消化、再贴壁的过程,而这一过程必将引起细胞活性及其利用率降低。牛脱钙皮质骨基质(bDBM)为天然骨成分材料,已有部分体内、体外研究证明其具有良好的细胞黏附性、成骨活性及生物相容性。文献囿表明在脱钙骨基质(DBM)中,骨形态发生蛋白乇、转化生长因子-β等蛋白成分在干细胞成骨分化过程中起主要作用。但在体外干细胞培养过程中,成骨诱导活性将引起成骨分化并降低干细胞的扩增效率,因此在追求干细胞高效扩增的目标下,应尽量去除该活性成分。本实验中我们设计并制各出无成骨诱导活性的牛去蛋白脱钙皮质骨基质(bDpDBM),比较其与bDBM在干细胞体外培养中的优、缺点,初步探讨其作为可移植型微载体制各候选材料的可行性。

材料与方法

一、实验材料3个月龄新西兰大白兔3只(由第四军医大学实验动物中心提供),新鲜牛四肢骨、甲醇、氯仿、盐酸(由第四军医大学全军骨科研究所提供),达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBs)(αb∞公司,美国),胎牛血清(fet赳bc,lrinc semm,FBS)(BD公司,美国),乙二胺四乙酸钠(EDTA)、噻唑蓝(MTr)(南京建成生物工程研究所),碱性磷酸酶(ALP)活性定量检测试剂盒、钙定量试剂盒(Gellmed公司,上海),扫描电镜s-3400N(Ⅲtach公司,日本),生物显微镜BⅩ40(olympus公司,日本)。

二、实验方法

(一)bDBM及bDpDBM的制各DBM材料的制各按照Urist和⒌ratcsI:]的方法,取新鲜健康成年牛四肢骨皮质骨段,去除骨髓及表面软组织附着,砸成碎片,置于-80℃过夜,灌注液氮环境下冷冻研磨粉碎,用滤网筛选出直径为⒛0~500 um的颗粒,蒸馏水漂洗3次去除残留的血液成分,按照微颗粒质量⒈3处理液体积进行随后脱脂、脱钙、脱蛋白,使用试剂包括甲醇、氯仿、盐酸、氯化钙、EDTA、氯化锂等,分别于脱钙及脱蛋白末再次筛选出直径为20O~5OO um的颗粒,分别形成本实验所采用的bDBM及bDpDBM两种颗粒材料,冻干并经环氧乙烷(ethylenc c,xide,EO)消毒后4℃无菌保存。

(二)兔BMSCs的分离与体外培养取3个月龄新西兰大白兔3只,体质量约2炖,雌雄不限。于髂骨处抽取骨髓4mL,以密度梯度离心结合贴壁筛选法分离和培养BMSCs。将4mL骨髓缓慢滴加入4mL淋巴细胞分离液上,以⒛00r/而n离心⒛min(离心半径为250px),小心吸取中间界面乳白色云雾状单个核细胞层,PBS洗涤2次,加入DMEM完全培养基(含体积百分比为10%的FBS),接种于⒛c硭培养瓶中,5%C02、37℃饱和湿度培养5 d,半量换液,此后每周换液2次。待细胞长满80%后进行传代培养,取P~3代细胞进行后续实验。

(三)用微颗粒进行干细胞培养

利用12孔板进行微颗粒对BMsCs的平板培养实验,每孔分别添加bDBM和bDpDBM微颗粒1.2g(铺满12孔板),接种细胞量为2×106。两组给予相同处理条件,即接种前zh以PBS对微颗粒进行预泡,接种时以含10%FBS的DMEM培养液置换,然后吸去培养液,每孔添加细胞悬液100uL,2h后添加1.5mL培养液并轻柔搅拌使微颗粒翻面,随后隔天换液,换液时用新培养液漂洗1次后另加1.5mL新鲜培养液。

(四)实验分组及检测项目

1.实验分组:实验组包括bDBM组和bDpDBM组,在进行ALP活性、胞内钙定量的检测中,两组互为对照,并同时设立经同期平板培养的BMSCs为空白对照(标记为control,为在12孔板中以与微载体种植对等的细胞密度及处理方式培养);在进行MTT检测和绘制生长曲线时,因材料本身会吸收MTT而形成背景结果,故设置以等量两种材料为对照组(分别标记为bDBM¨colltrol组及bDpDBM~control组),与实验组进行同等处理,检测结束后除去此部分的影响以明确细胞扩增特征。

2.MTT检测与生长曲线绘制:分别于接种培养后第1、3、5、7、9、11、14天进行,于检测当天按照换液过程更换培养液,并同时用吸管吸取微颗粒,置于新的12孔板中,添加培养液漂洗一次,后添加含80uL MTT溶液,置于37℃培养箱中孵育4h,吸去培养液,每孔加人600uL二甲基亚砜溶液,震荡10min充分溶解MTT结晶,随后用⒛0uL移液器吸取3次150 uL至96孔板中进行吸光度(A)值测定,每次检测在12孔板中随机选择3孔进行检测,共生成9个数据进行分析;绘制生长曲线时,以两实验组分别减去同期各自对照组所测数据作为当期细胞测量结果,并依此绘制生长曲线图。

3.成骨分化检测:ALP染色(钙钴法):检测前1d消化分离细胞并进行玻片爬片,次日固定后加人孵育液(含巴比妥钠、β-甘油磷酸钠、氯化钙及硫酸镁等)并于37℃下孵育15min,水洗后加入硝酸钴溶液并孵育5而n,水洗后加人硫化铵1血n,蒸馏水洗后甘油封片,光镜下可见黑色沉淀表示酶活性。ALP活性定量检测:分别于种植后第3、7、14、21、28天进行,步骤按照产品使用说明书进行,即两实验组分别在细胞消化计数后取106细胞,检测该单位数量细胞内的ALP活性并标准化至蛋白定量,每次重复3次取样测量。钙含量测定:分别于种植后第3、7、14、21、28天进行,于两实验组中分别在细胞消化计数后取106细胞置于0.5m。l/L的乙酸中过夜溶解钙结晶,随后按照操作指南(ca1cium洮say h,上海杰美基因)进行胞内钙含量测定,每次重复3次取样测量。

4.扫描电镜镜检:用吸管吸取标本后以PBS漂洗2次,加人质量百分比为2.5%的戊二醛固定液,4℃保存并送检,检测时吸去固定液后,乙腈梯度脱水(35%,50%,75%,⒛%梯度,后100%乙腈3次脱水),真空干燥后喷金,扫描电镜镜检(S-34OON)。5.三向诱导实验:将细胞消化分离后,离心去除颗粒残渣,添加新培养液进行平板培养,待细胞铺满70%~80%时,分别加入成骨、成软骨及成脂诱导液,隔天换液,3周后分别进行茜素红染色、阿利辛蓝染色及油红0染色。

(五)统计学处理应用SPSS17,0统计学软件,计量资料以兖±s表示,对两实验组的MTT吸光度(A)值的比较采用配对莎检验,两实验组及平板培养对照组的ALP定量及细胞内钙含量采用单因素方差分析,组内两两比较采用sNK-g检验,P<0。Os认为差异有统计学意义。结果微颗粒制各:经制各获得的微颗粒大小较为统一,电镜下观察其直径以300~笱0um为多,为类球形,表面粗糙,含较多孔隙,以bDpDBM组更显著(图1)。BMscs分离及平板培养扩增:原代培养第5天时细胞贴壁,第7天时半量换液,第14天时铺满80%,予以传代培养,至第21天时传至"代;接种至两组微载体进行培养第14天后显示bDpDBM组细胞扩增较快,与bDBM组相比差异有统计学意义(P(0∞,表1、2,图2)。成骨分化检测结果:第28天时bDBM组培养细胞ALP染色阳性,ALP定量及胞内钙含量均明显高于bDpDBM组和平板对照组,差异均有统计学意义

参考文献

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