负压封闭引流技术联合臭氧水冲洗治疗铜绿假单胞菌感染性创面的实验研究

负压封闭引流(VSD)技术由Flcischmann博士于1992年首创并用于开放性损伤的治疗,且取得了良好的疗效[1]。研究[⒉6J发现VSD技术可以促进创面血液循环,增加血供,同时还有抑制细菌繁殖的作用。目前VsD技术已广泛应用于肢体开放性损伤I⒎91,但其也存在一些问题,如引流孔堵塞、创面积液感染加重等。一旦出现明显的感染需要及时拆除或更换VsD装置,因此会增加患者痛苦,延长住院时间等。随着VSD技术的发展,现在临床上已有自带冲洗管道的负压引流材料,经冲洗管道注人生理盐水、庆大霉素等冲洗液,在一定程度上起到了稀释分泌物、减少引流孔堵塞的作用。文献1n.3]报道臭氧水不仅可以快速消毒杀菌,而且还可以促进创面愈合,如经VsD冲洗管道注人一定浓度的臭氧水,对感染性创面既可有效杀菌又可以促进创面修复。为此,我们设计铜绿假单胞菌感染性创面的动物模型来进行验证。

材料与方法

一、实验动物、仪器及材料取7~9周Wistar大鼠细只,体质量为260~320 g,雌雄各半(由南方医科大学实验动物中心提供)。实验细菌为铜绿假单胞菌临床株(由南方医科大学南方医院微生物室提供)。臭氧水制各仪(德国)、VSD材料(武汉维斯第医用科技有限公司)、VSD-M-P型VSD负压引流专用吸引器、细菌温室培养箱(美国)、震荡培养箱(SPⅩ-1ooB~D型,上海博讯实业有限公司)、光学显微镜(o1ympus PD72型)、肿瘤坏死因子姐试剂盒及表皮生长因子(epiClermal growth factor,EGF)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)、固体琼脂平板及肉汤培养基、HE染色相关材料及设各。

二、实验方法1,实验分组:采用随机数字表将Wis咖大鼠分为5组:VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组,VSD联合10 mg/L臭氧水冲洗组,VSD联合庆大霉素冲洗组,VSD联合生理盐水冲洗组和常规换药组,每组8只。2臭氧水的制各:将灭菌注射用水倒人臭氧水制各仪出水槽中,开启电源,调节制取浓度,约5min臭氧水制各成功。按此方法分别制取浓度为5、10mg/L的臭氧水,所制取臭氧水浓度在实验前经碘量法检测浓度符合实验要求。3.菌悬液制各:严格按照细菌培养要求将铜绿假单胞菌接种于普通固体琼脂平板,温室培养箱培养z h(温度为36℃),然后挑取单一菌落接种于肉汤培养基,置于震荡培养箱继续培养叫h(温度为36℃)后制各浓度>⒛×109/mL的菌悬液各用。4.动物实验过程:①麻醉方法:戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉。②动物皮肤缺损感染模型的建立:实验前以h Wistar大鼠背部剃毛,然后用质量百分比为6%的硫化钠在大鼠脊背侧脱毛备皮,术前8h禁止进食和饮水。麻醉满意后Wistar大鼠背部用酒精消毒3次,铺无菌巾,制各75px×50px皮肤缺损,创面深达肌层,常规压迫止血后涂抹已制各好的绿脓杆菌菌悬液并用敷料覆盖。③各组Wis泗大鼠造模后常规喂养,48h后观察造模成功,立即病灶清除和压迫止血,各冲洗组覆盖VsD敷料缝合固定于周围皮肤,贴膜并检验无漏气,常规换药组病灶清除后更换敷料覆盖。各冲洗组将Wistar大鼠固定后接负压源并持续负压吸引[压力为-120mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)]。术后VSD联合冲洗组以2mL/次经冲洗管注人5、10mg/L臭氧水、庆大霉素(16万U加入500mL生理盐水)及生理盐水冲洗。每次注入时关闭负压2血n,然后开启负压1血n,反复5次,共15m血,间隔12h重复1次,常规换药组每天换药1次,术后共治疗5d。各组造模时及造模后切断鼠尾采血行白细胞总数检测,治疗结束时心脏采血行白细胞总数检测。各组造模时、造模后及治疗5d时局部取肌肉组织通过酶联免疫吸附实验(cnzyme linked血munosorbcnt as盯,ELIsA)进行TN「α及EGF含量的测定。各组治疗5d时局部取肌肉组织经甲醛固定后行HE染色光学显微镜观察。

三、统计学处理‘应用SPSSI3.0统计学软件,计量资料用厉±s表应细胞浸润,VSD联合生理盐水冲洗组和常规换药组见大量炎性反应细胞浸润(图2)。

讨论VSD技术已广泛应用于各种创面的治疗并取得较好疗效,其作用机制目前仍在探讨中。胡祥等研究发现VSD技术可以减少核因子KBα阻滞剂(IKBα)磷酸化,抑制感染创面细胞黏附分子-1的表达,从而减轻感染创面炎性反应。刘洋等研究发现VSD减轻创面炎性反应可能与增加创面局部血流量、提高创面组织炎性细胞数量、促进血管内皮生长因子的mRNA表达有关。杨帆等[16]研究发现VsD技术可以下调细胞TN⒎α的表达而减轻炎性反应。臭氧及臭氧水具有高效的杀菌效率,史利克等71研究发现5 mg/L及以上浓度的臭氧水对多种细菌作用1杀灭率可达100%。余斌等研究发现臭氧水还可以促进创面修复,其作用机制可能与高效杀菌效率、下调TNF诹及上调EGF的表达有关。因此,VSD技术和臭氧水在治疗感染性创面修复过程中可能会有部分协同作用,即可能同时对TN孓α和EGF表达进行调节。与刘洋等[bl单纯VSD技术治疗铜绿假单胞菌感染性创面的研究相比,本实验将VSD与臭氧水联合治疗铜绿假单胞菌感染性创面,且选择以铜绿假单胞菌临床株造模更具有参考性,这是本实验的创新之处:在治疗5d时我们发现VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组可见创面较红润,无明显分泌物渗出,有大量肉芽组织生长,局部创面肌肉组织HE染色光学显微镜观察炎性反应细胞浸润也最少,血常规白细胞总数恢复至正常水平,创面外观明显优于其他组。同时VsD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组TN⒎α表达水平明显低于其他组,以VsD联合10mg/L臭氧水冲洗组表达最低。而EGF的表达也以VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组最高。TNα为各种炎性反应的关键刺激因子,表达降低可以减轻炎性反应,而EGF增高可有效地促进创面修复。La等研究也发现EGF可以有效地促进创面愈合。这与VSD技术联合臭氧水治疗感染性创面修复过程中可能存在部分协同作用有关。目前,VSD技术联合臭氧治疗创面已有临床报道,但十分有限。黄显凯等[2Ol研究发现臭氧联合VSD技术可有效降低创面炎性反应,明显促进创面愈合。臭氧水作为一种强氧化剂,有动物研究[21]发现单纯浓度33mg/L以下的臭氧水对机体不会产生损害。但是臭氧水与VSD材料长期相互作用后可能产生有害物质对细胞等构成毒性反应,也可能影响VsD材料的理化性质,且臭氧水浓度越高产生影响的可能性越大。尹海磊[22]研究发现浓度为10mg/L臭氧水浸泡VSD材料⒛min,对其物理性能无改变,因此,VSD技术联合10mg/L臭氧水治疗感染性创面在理论上有一定可行性。但二者多次相互作用后的浸泡液对细胞组织等有无毒性反应目前尚缺乏实验研究,尚需进一步通过细胞毒性实验进行验证。

综上所述,动物实验表明VSD技术联合5、10 mg/L臭氧水冲洗治疗感染性创面的疗效明显优于常规换药及VSD技术联合庆大霉素或生理盐水冲洗,其中VSD技术联合10mg/L臭氧水冲洗疗效最好。

参考文献

[1]Fleischmann W,Strecker W,Bombelli M.Vacuum sealing as treatment of soft tissue damage in open fractures[J].Unfallchirurg,1993.488-492.

[2]Malmsj(o)M,Ingemansson R,Martin R.Wound edge microvascular blood flow:effects of negative pressure wound therapy using gauze or polyurethane foam[J].Annals of Plastic Surgery,2009.676-681.

[3]Petzina R,Gustafsson L,Mokhtari A.Effect of vacuum-assisted closure on blood flow in the peristernal thoracic wall after internal mammary artery harvesting[J].European Journal of Cardio-Thoracic Surgery,2006.85-89.

[4]Weed T,Ratliff C,Drake DB.Quantifying bacterial bioburden during negative pressure wound therapy:does the wound VAC enhance bacterial clearance[J].Annals of Plastic Surgery,2004.276-279.

[5]Mou(e)s CM,Vos MC,van den Bemd GJ.Bacterial load in relation to vacuum-assisted closure wound therapy:a prospective randomized trial[J].Wound Repair and Regeneration,2004.11-17.

[6]Morykwas MJ,Argenta LC,Shelton-Brown EI.Vacuum-assisted closure:a new method for wound control and treatment:animal studies and basic foundation[J].Annals of Plastic Surgery,1997.553-562.

[7]Li RG,Yu B,Wang G.Sequential therapy of vacuum sealing drainage and free-flap transplantation for children with extensive soft-tissue defects below the knee in the extremities[J].Injury.British Journal of Accident Surgery,2012.822-828.

[8]黎晓华,王惠东,张长青.封闭式负压引流技术联合皮瓣修复下肢皮肤软组织缺损[J].中国修复重建外科杂志,2010.722-725.

[9]Liu L,Tan G,Luan F.The use of external fixation combined with vacuum sealing drainage to treat open comminuted fractures of tibia in the Wenchuan earthquake[J].International Orthopaedics,2012.1441-1447.

[10]成亮,柴益民.持续负压吸引技术治疗肢体皮肤软组织缺损并发症分析[J].中国修复重建外科杂志,2010.1354-1356.