骨髓增生异常综合征患者骨髓铁调素水平的研究

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes , MDS)是起源于造血千细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少和造血功能衰竭，高风险向急性髓细胞白血病转化MDS患者的铁过载主要由输血依赖和红系无效造血引起过多的铁会导致产生大量的氧自由基，破坏细胞，尤其是心肌细胞和肝细胞的DNA,蛋白质、脂质结构等，最终导致不可逆的损害4〕。如何准确评估MDS患者铁过载水平成为临床工作的一项难题。铁调素是肝脏分泌的一种多肤，通过与膜铁转运蛋白结合(ferroportin)运送铁出胞来调节体内铁环境5。它受体内铁负荷、炎症、缺氧和红系造血等因素的影响6。生长分化因子15 ( growth differentiation factor 15 , GDF15)已经被证实能够抑制铁调素的生成7。有研究a.9显示，原肠胚扭转同系物1 ( twisted gastrulation 1 , TW SG1)在红系分化早期的表达远远高于成熟红细胞，是潜在的铁调素调节基因。除此以外，免疫因素，尤其是淋巴细胞对于铁调素的表达也至关重要.磁共振成像 T2 ' ( magnetic resonance imaging T2 ), MRI T2)是目前评估心脏和肝脏铁含量的金标准「12〕。MRI T20‘技术能快速测定出脏器的铁含量,T2’值可作为辅助检查脏器功能的参数。因此，我们运用MR工T2*技术来测定MDS患者心脏和肝脏的铁负荷，并结合骨髓血清铁调素和血清铁蛋白(serum ferritin , SF)评估铁过载程度。本研究通过测定患者外周血和骨髓血清铁调素、SF、促红细胞生成素(erythropoietin , EPO ) , C反应蛋白(C-reactive protein , CRP ) , GDF15 , TWSGl , 淋巴细胞分类(C D4十和CD19十),T淋巴细胞极化和 MRI T2‘等指标，并结合其他参数对MDS患者的铁过载程度进行评估。

1.对象与方法

1. 1对象和分组

1. 1. 1 MDS组(二=64)所有病例均为上海交通大学附属第六人民医院血液科2009年1月一2012年 4月间门诊和住院的MDS患者，共64例，其中男性 38例，女性26例;年龄19 } 87岁，中位年龄62岁。 MDS的诊断参照WHO 2008诊断标准’3〕，其中难治性血细胞减少伴有单系增生异常型( refractory cytopenia with unilineage dysplasia, RCUD ) 9例，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多型( refracCory anemia with ring sideroblasts , RA RS ) 5例，难治性血细胞减少伴多系增生异常型( refractory cytopenia with multilineage dysplasia , RCMD ) 21例，难治性贫血伴原始细胞增多型(refractory anemia with excess blasts, RAEB;包括 RAEB1和RAEB2 ) 21例，iVIDS不能分类型(MDS- unclassified , MDS-U ) 8例。病情分级参照国际预后积分系统(International Prognostic Scoring System , IPSS)和 }'HO分型为基础的预后积分系统(WHO-Based Prognostic Scoring System, WPSS ) 。参照IPSS积分，染色体核型分层好(正常)46例，中14例，差 4例;高危组24例，低危组40例。参照W PSS积分，高危组28例，低危组36例。42例既往有输血史， 22例无输血史;患者是否输血依赖的诊断标准参照 NCCN指南’6，其中30例患者有输血依赖，34例患者输血非依赖。

1.1.2正常对照组(n = 28)选择28名健康志愿者作为对照组，均知情同意，其中男性18名，女性 10名;年龄17 } 70岁，中位年龄39岁;染色体核型均正‘常。

1. 2方法

1. 2.1 EL1SA检测外周血和骨髓的铁调素水平受试者的外周血和骨髓液标本在离心前静置30 min , 然后以1 000x g的速度离心15 min。采集上清层于一20℃保存待用。外周血和骨髓液的铁调素水平采用ELISA法检测，试剂盒购自美国Cusabio Biotech公司，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 Real-Time PCR法检测骨髓GDF15和TWSGl mRNA的表达采用德国Qiagen公司的RNeazy Mini Kit试剂盒抽取骨髓总RNA o 10 },L总RNA通过随机引物法反转录为cDNA，试剂盒购自加拿大Fermenla、公司，以[操作均按照试剂盒说明书进行。总体积为20 }, L的1'CR反应体系:2 }L cDNA + 10 LA,L SYBR) Premix及Tcz犷Mj[ ( Takara，日本)十 0. 4 },L土游引物+0.4 }L下游引物+7.2 OL RN ase-Free水扩增条件:变性95 0C 5 s，退火62 0C 20*，延长72℃10*，共40个循环运用2一“}c:}法进行数据分析。

1.2.3流式细胞仪检测'I'淋巴细胞的亚型(CD4', CD19)和极化通过Beckman流式细胞仪对22名无输血史的患者进行CD4' ,C1)19一淋巴细胞和T细胞极化的测定，测定方法参照既往报道”分组标准:CD4一>35. 28%为高表达组，CD4 -, 35. 28 rk为正常组;CD19'>25.24%为高表达组,CD19一,}5. 24% 为正常组;Th 1 /Th2 > 70. 6为极化组.Thl/Th2,70.6 为正常组

1.2.4采用VI RI 1'2‘技术测定心脏和肝脏铁沉积程度D}1 RI T2‘的理论基础是铁沉积会扰乱磁场的均匀分布，在浓度依赖测定法中可以缩短fl加权和 T2加权时一间。对24名既往接受过输血治疗的VI D s 患者进行}VJ RI T2的检测采用德国西门子公司 3. OT核磁共振仪，测定序列为一个10一15呼吸静止多层回波T2序列在心脏左心室室间隔和肝脏实质圈定目标区域(re幼on of interest , ROI )测定平均 T2;值，根据数值制作衰减曲线，代人运算方一程后获得心脏'C2值和肝脏铁浓度(liver iron concentration , T.IC尸H。心脏「t2值< 20 m*和(或)LIC > 2 m}i 被视为铁过载4。

1.2.5 SF,CRP和FPO白勺测定受试者外周血中 SF,CRP及EPO水平均由本院中心实验室测定，其中 SF采用放射免疫法测定，(:RP采用免疫比浊法测定， EPO采用免疫发射法测定

1.3统计学处理 采用SPSS 17. 0软件进行统计学分析，Z态分布 的数据以:x士、表示，两组问比较采用t检验;非正态分 布数据以中位数(最小值一最大值)表小，数据经对数 转换为正态分布后再进行C检验;多组问比较采用方 差分析。铁调素与SF、心脏'I'2值、LIC的关系采用逐 步回归分析;采用Pearsom相关系数表示铁调素与其相 关因素的关系P < 0. OS表示差异有统计学意义。

2结果

2. 1两组人群的基本资料 I}ZDS组和正常对照组的骨髓和外周血检测指标见 表l } MDS组患者的心脏T2值为(25. 78士1. 82) ms, I.IC为(17. 66士1. 87)mg/g。

2. 2骨髓和外周血铁调素水平MD`患者的骨髓铁调素水平为(264. 13士102. 15 )ng/ mL，外周血铁调素水平为(301. 62 1 I 11. 56 ) na/mI. ,两者比较差异无统计学意义(P > 0. 05}(图1)。

2. 3根据}V H 0分型分析vIDS患者 MDS各分型间的骨髓铁调素水平呈现异质性，各组间比较差异有统计学意义(P = 0. 041 )，其中 RA RS组铁调素水平最低，难治性贫血伴原始细胞增多型(RAEBI + RAER2 )铁调素水平最高。SF,CRP}J', EPO和GDF15 mR1TA在各型之间同样表现出异质性，各组间比较差异均有统计学意义(P <0.01);但 T}'SG1、心脏T2‘和1,1C水平在各型之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2. 4根据IPSS积分和WPSS积分分析MDS患者 根据IPSS积分分组，除骨髓铁调素水平外，高危组与低危组的SF, CRP, EPO , GDFlS mRNA和TES SG1 ,Ii}TA水平比较差异均无统计学意义(P >0.05)} 根据wPSs积分分组，高危组与低危组的铁调素、 SF,GDF15 mRNA水平比较差异均有统计学意义(P < 0. OS或P < 0. 01 )，但两组间EPO和T}jSGl mRNA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)

2. 5根据是否输血依赖分析MDS患者 输血依赖组MDS患者骨髓上清铁调素水平显著低于输血非依赖组患者，差异有统计学意义(P <0.01); 但输血依赖组患者的SF,EPO,GDF15 mRl1A,TWSG1 mR}VA和LIC水平均显著高于输血非依赖组，差异有统计学意义(P < 0. O1)(表4)。

2. 6铁调素水平与S玖心脏T2值、LIC的相关性分析 将24名接受过MRI T2‘检测患者的骨髓铁调素水平与其S玖心脏T2*值和L1C 3个参数进行逐步回归分析，发现LIC是唯一与铁调素相关的因素 (r=0.582,P<0.001)，因此将SF和心脏`I'2’值剔除。

2. 7铁调素水平与淋巴细胞分类和T淋巴细胞极化的关系 22例从未进行过输血治疗的患者中，C D4+高表达组的骨髓铁调素水平显著高于正常组，差异有统计学意义(p=0.02);CD19十高表达组的骨髓铁调素水平与正常组间比较，差异无统计学意义(尸= 0. 206 );极化组的骨髓铁调素水平显著高于正常组，差异有统计学意(P < 0. 001)(图2)0 2. 8 MDS患者铁调素水平的相关因素 为了评估MDS患者骨髓铁调素水平的独立相关因素，我们建立了一个多因素线性回归模型，涵盖以上所有检测指标，结果显示CRP ( r = 0. 302 , P = o. o01)和LIC(r=0.298,P=0.031)可能是MDS患者骨髓铁调素水平的独立影响因素(表5)

3讨论

MDS患者铁过载主要由输血依赖和红系无效造血引起。JI-研究表明，输血依赖与生存时间和白血病转化之间存在重要联系。铁调素作为一个肝脏分泌的多肤是人体铁代谢过程中的重要调节因素}z}。我们的研究试图通过测定铁调素及其相关因素，如SF, CRP, GDFIS ,TWSGl等建立一个MDS患者铁过载的评估体系。

先前对于铁调素的研究大多用患者外周血和尿液作为对象，本研究则采用骨髓液，研究骨髓中的铁调节机制。首先，检测结果显示64名MDS患者外周血与骨髓的铁调素水平差异，提示骨髓的铁代谢调节可能与外周血相似。

与Santini等[23]的研究结果类似，MDS患者铁调素水平在各型之间呈现较大的异质性。血细胞的染色体核型异常和输血治疗可能导致疾病的进展，所以我们引人IPSS积分和WPSS积分进行分层分析。结果显示，输血依赖作为独立于细胞遗传学分组的危险因子19，可能是导致MDS患者铁过载的主要原因输血依赖对预后的影响不仅与IYIDS的严重程度有关，也可能与患者的铁过载有关“。

我们建立了一个铁调素与S玖心脏T2值和LIC 的逐步回归分析模型。尽管SF单因素与铁调索存在显著相关性(:=一0.021,P=0.047)，但是放人逐步回归模型后，仅有LIC一个因素显示有统计学意义的相关性(r=0.582,P<0.001)。由此可见，MRI T2检查具有比SF检测更多的优越性，不仅无创和快速，而且结果对于评估脏器铁过载更为精准。因此，我们建议如果条件允许，MDS患者无论是否接受过输血治疗，都应该进行MRI 1'2‘检测评估内脏的铁负荷水平。但是，我们认为SF的质量浓度>1 000 ng/mL仍旧可以作为一个诊断铁过载的指标。

GDF15和T}SG1已经被证实为铁调素的负调控因子92“一。本研究测定了MDS患者的骨髓GDF15 和T}'SG1 mRNA表达水平，结果显示输血依赖患者的相对表达量分别是输血非依赖患者的6倍和2倍，但是两者与铁调素均不存在相关性。因为红系无效造血在铁过载中是一个长期的过程，因此在评估 GDF15和TWSG1的基因表达时有必要将输血考虑其中。同时也有研究7」表明，抑制铁调素的表达需要较高的GDF15水平。

Pinto等的研究证实，当T淋巴细胞活化后，铁调素mRNA表达水平升高，CD4‘和CD19十淋巴细胞表达的铁调素mRNA水平较CD8十淋巴细胞高 2倍左右。T细胞极化也是反映体内免疫状态的指标之一。因此，我们在未经输血治疗的患者中进行了CD4',CD19和T细胞极化的测定，寻找在剔除了输血背景的患者骨髓中，免疫因素，尤其是T细胞对于铁调素表达的影响。结果显示，C D4十高表达组铁调素水平高于正常组，极化组也显著高于正常组， CD19十高表达与正常组间比较无统计学差异。由此看来，铁调素水平的差异可能正是由于T细胞活化所导致，这与先前报道的在急性炎症T细胞活化后，血清铁水平的变化情况相同’25研究26’表明，部分l D S患者与正常人比较，T细胞存在向I型细胞极化现象;同时骨髓上清液中存在与Thl细胞呈现正相关的肿瘤坏死因子。(tumor necrosis factor-a,TNF-a) 水平升高"' } TN F-。在淋巴细胞中通过铁一转铁蛋白转运体(holotransferrin . Fe-TF)介导铁调素的生成ion。因此，I型细胞极化明显的患者产生更多的 TNF-a，导致铁调素水平升高。另一方面，由TN F-a 激活的炎症刺激抑制血幼素(hemojnvelin , HJ}T ) mRNA的表达，从而在炎症发生时抑制铁调素产生，防止血铁过少。近年的一项研究2Y表明，TN F-。和 CD4一细胞间在青少年迟发性高敏反应中存在联系，提示CD4十细胞和T细胞极化在铁调素的调节通路中起到协同作用的可能，但是「淋巴细胞的一系列变化是在铁过载发生前还是发生后尚有待研究由此考虑，炎症因素仍然是铁调素表达的关键影啊因素，少已其在T淋巴细胞活化之后CRP作为反映炎症的一个指标，与铁调素的表达也呈现出较为密切的相关性(r=0.302 ,P=0.001)

综上所述，炎症因素是铁调素表达的关键因素， T,1C对于评估患者脏器铁负荷较SF更为精确，淋巴细胞的免疫状态可能是调节铁调素表达的潜在影响因子，不过推论有待于进一步证实。

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