无血清条件下骨髓间充质干细胞增殖及分泌VEGF的实验研究

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化、自我增殖的能力,且取材方便、易于培养增殖,成为目前医学组织工程学理想的种子细胞[叫。心肌梗死的治疗与血管新生密切相关,VEGF是一种促进血管生成的重要细胞因子。因此,能够旁分泌血管内皮生长因子(VEGF)是BMSCs移植治疗心肌梗死取得疗效的另—个重要因素[3-4]。目前,越来越多研究证实,BMSCs在移植治疗心肌梗死方面具有确切疗效,然而对于BMSCs移植到缺血缺氧组织后,细胞生存及功能状态的变化尚不清楚。本实验通过无血清培养模拟体内缺血环境,探讨BMSCs在缺血环境下自身增殖及分泌VEGF的规律,为BMSCs在治疗心肌梗死方面提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 3周龄SD大鼠,雌雄不限,体质量110~130g,由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 胎牛血清、胰蛋白酶、HG-DMEM培养基(美国Gbco公司);大鼠IgG1-PE、大鼠IgG1-FITC、仓鼠坨G1—PE、CD29—PE、CD刂4~PE、CD90-FITC、CD34-PE、CD45—PE(美国⒊gma公司);VEGF165ELIsA试剂盒(美国RD公司);Anne蛀n V ApotOsis Detecti°n Kit(美国BD Pharmigen公司)。

1.3 3主要仪器FORMA3111水套CO2培养箱(美国Thermo公司);倒置相差显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司);流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 BMSCs的分离 取SD大鼠,3%戊巴比妥钠2mL/kg腹腔注射麻醉,将其置于75%乙醇中浸泡15min。无菌条件下去除大鼠双下肢皮肤,钝性分离肌肉组织,完整取出股骨。将取出的骨头置于装有无菌磷酸盐缓冲液(PBS)溶液的培养皿中反复冲洗除去骨头外面的血液及残留肌肉组织;钳剪股骨两端软骨,剩下骨干。用10mL注射器抽取含20%胎牛血清(FBS)的HG DMEM培养基6mL,将注射器针头插人骨髓腔内反复冲洗,直至骨髓腔无骨髓组织残留。收集骨髓悬液于15mL离心管中,1500t/min室温离心8min,弃上清,用10mL含20%FBs新鲜HG-DMEM培养基重悬细胞,转移至2个T-25cm2细胞培养瓶中。

1.4.2 大鼠BMSCs的原代培养 置于5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中培养。24h后用含10%FBS新鲜HGDMEM培养基更换旧培养液,同时弃去未贴壁细胞,以后每3天更换培养基1次。细胞长满瓶底接近90%时,进行传代培养。

1.4.3 大鼠BMSCs传代扩增培养原代细胞长满至培养瓶底约90%时,除去旧培养基,加人无菌PBs溶液以去除残留培养基,再除去PBS溶液。加人0.25%胰蛋白酶1mL消化细胞,镜下观察细胞之间突起消失、细胞变圆钝后,除去胰蛋白酶;接着加人含10%FBS的HG-DMEM细胞培养基,并用吸管轻柔吹打瓶底贴壁细胞成单细胞悬液。按1:2传代,传代后细胞置于37C,5%CO2的培养箱中继续培养。第1次传代细胞为P1(第1代),以后每隔3~4d传代1次。

1.4.4 大鼠BMSCs的鉴定 P3代细胞长至瓶底约90%,用胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬液,细胞汁数仪辅助下,调整每支检测管为5×10’的细胞数目。室温下1000r/min离心5 min,去除上清液。用无菌PBs洗涤检测管细胞2遍,最后每个检测管各加人100ul无菌PBs溶液,加人CD29、CD34、CD狃、CD吐5、CD90一抗及同型阴性对照各10uL,小心摇晃均匀。室温下避光孵育15min,每检测管再加人无菌PBS l mL后于流式细胞仪检测各项指标。

1.4.5 无血清培养下BMSCs凋亡情况 取P3代BMSCs,按1×1O4/接种于24孔培养板中,接种后先用含10%FBS培养12h,待细胞贴壁后,换为无血清DMEM培养基继续培养,然后在第12、24、36、48、72、96h随机抽取3孔(实验重复5次),消化细胞离心后转移到流式细胞仪专用检测管,并按凋亡检测试剂盒说明操作(Alallcxin VPE及7AAD双染),上机检测细胞凋亡情况。146 VEGF表达水平根据无血清培养的时间,将骨髓间充质干细胞分为无血清培养12、24、36、48、72h组,每组细胞均独立培养在一个24孔细胞培养板,每次检测均做副孔,实验重复3次,以ELIsA法检测VEGF的分泌水平,ELIsA操作步骤依照说明书进行。

1.5 统计学处理 采用SPsS13O统计软件进行分析,计量资料以x±s,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠BMSCs的培养 刚转移至培养瓶时BMSCs为悬浮呈球形的单个核细胞。6~8h显微镜下可观察到部分细胞开始沉降至瓶底并贴壁生长。24h首次更换培养液,多数细胞已贴于瓶底生长,不随换液而流失。但贴壁细胞数目较少,可呈短梭形或多角形(图1A)。首次换液后细胞生长增殖加快,细胞偶有双核,细胞集落形成可于接种后第3天开始出现,细胞形态也发生变化,可为短棒状或纤维样,旋涡状或平行排列(图1B)。传代后细胞生长迅速,6d后相邻集落可融合成片,类似纤维细胞状长满培养瓶底,细胞间界限可变模糊,P3细胞第6天,见图1C。

2.2大鼠BMSCs细胞表型 P3BMSCs细胞表面标志物经流式细胞仪鉴定结果:CD29、C)D碴4、CD9O阳性,而CD34、CD45阴性,符合大多数文献所报道的BMSCs表面特征。

2.3 无血清培养下BMSCs凋亡情况 BMSCs无血清培养12、24、36、48、72h后细胞凋亡率分别为(7.93±0.41)%、(8.51±0.55)%、(8.58±0.31)%、(8.67±0,25)%、(8.3±0.41)%,组间比较差异无统计学意义(P>0.05);在培养96b后凋亡率为(9.93±0.44)%,与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.03

2.4 VEGF表达水平BMSCs无血清培养12、⒛、36、48、72 h后VEGF浓度分别为(354.3±12.9)pg/mL、(395.8±11.2)pg/mL、(432.7±16.0pg/mL、(472.9±13.5)pg/mL、(512.1士12,3)pg/mL,随着无血清培养时间的延长,BMSCs分泌VEGF逐渐增多(P<0.05)。

3讨论

BMSCs移植治疗心肌梗死等缺血性心脏病取得疗效包括以下几方面因素[5-7]:分化为心肌样细胞、血管内皮样细胞、旁分泌多种细胞因子、促进新生血管形成,从而增加缺血部位血液供应、改善心脏功能,达到治疗目的。

已经证实BMSCs在体内或体外都能分泌一些促进血管生成的细胞因子[4],其中就包括了VEGF。VEGF是一种强效促进血管生成的细胞因子,可促进心肌缺血区血管新生,形成新的毛细血管网,增加侧支循环,改善血供,缩小心肌梗死面积。VEGF存在多种亚型,其中VEGF165是其主要活性形式之一,在机体中最常见、浓度最高,为可溶性,可以分泌到细胞外基质中发挥作用,故本实验以VEGF165作为检查VEGF分泌水平的指标[8]。

无论在急性心肌梗死区域还是在慢性心肌缺血部位,缺血都是引起心肌细胞坏死凋亡的首要因素。若周围血管可以形成侧支循环,则可以挽救濒死心肌细胞,而且,侧支循环血管越早形成,血液越早供应至缺血部位,损伤心肌细胞就可以越快恢复功能。血管的形成与血管内皮生长因子密切相关,故移植BMSCs至缺血梗死部位后,若能分泌更多的VEGF,则可以更快地促进血管的形成,以改善心肌供血。但对于BMSCs的移植时机尚存在争议,因为BMSCs移植到梗死部位后必定面临一个缺血的微环境,移植后其存活及作用能持续多长时间,何时需进行第二次移植,尚未有明确结论。这有赖于对BMSCs在缺血环境下的功能状态有着深人了解。由于移植后BMSCs整合于心肌组织内,对其功能状态的测定不易进行。故本实验通过体外无血清培养模拟体内缺血微环境,以确定BMSCs在这种环境下可存活时间及分泌VEGF的时间曲线。实验结果提示72h内BMSCs在无血清环境下凋亡率未明显增加,且在72h内VEGF随时间延长分泌逐渐增加。总之,本实验采用贴壁筛选法纯化扩增BMSCs,获得了足够数量且活力良好的细胞进行实验。通过体外无血清培养条件下,对BMSCs的凋亡及分泌VEGF的情况进行观察,表明BMSCs在一定时间内对无血清培养耐受良好,凋亡无明显增加,并且很好地分泌VEGF,这对我们下一步体内移植实验在移植时机及移植细胞预处理方面提供了良好的科学依据。

参考文献

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