姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞增殖的抑制作用
发表时间:2012-08-28 浏览次数:368次
作者:肖扬,王万春 作者单位:1. 中南大学湘雅医学院第二附属医院骨外科,湖南长沙 410083;2. 湖南省娄底市中心医院,湖南娄底 417000
【摘要】目的 观察不同浓度的姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞增殖的抑制作用。方法 将不同浓度的姜黄素(0、10、20、40μmol/L)作用于人骨肉瘤U2OS细胞12、24、48h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测U2OS细胞的增殖。结果 姜黄素可显著抑制U2OS细胞的体外增殖,并且随着浓度增加,抑制作用明显增强(10、20、40μmol/L的r值分别为-0.9638、-0.9778、-0.9764,P均<0.05);作用时间愈长,对U2OS细胞的抑制作用也愈明显(12、24、48h的r值分别为-0.9325、-0.9780、-0.9705,P均<0.05), 呈明显浓度和时间依赖性。结论 姜黄素能明显抑制人骨肉瘤U2OS细胞的体外增殖,可能为临床治疗骨肉瘤提供了一种新的方法。
【关键词】 姜黄素;骨肉瘤细胞;增殖
Inhibition of curcumin on proliferation of human osteosarcoma U2OS cells XIAO Yang, WANG Wanchun
(1. Department of Bone Surgery, the Second Affiliated Hospital of Xiangya Medical School, Central South University, Changsha 410083;2. Loudi Municipal Central Hospital of Hunan Province, Loudi 417000, China)
ABSTRACT: Objective To observe the inhibition of different concentrations of curcumin on cell growth, and explore the molecular mechanism of curcumin on human osteosarcoma. Methods Curcumin of different concentrations (0, 10, 20 and 40μmol/L) was administered to U2OS cells of human osteosarcoma for 12h, 24h and 48h, respectively. The proliferation of U2OS cells was measured by MTT assay. Results Curcumin significantly inhibited the proliferation of PC3 cells in vitro in concentration and timedependent manners. The higher the concentration of curcumin, the stronger the inhibition was (10μmol/L, 20μmol/L, 40μmol/L of r=-0.9638, -0.9778 and -0.9764, respectively, P<0.05). With the prolonged administration, curcumins inhibition on the U2OS cells became more obvious (Linear correlation analysis showed 12h, 24h and 48h of r=-0.9325, -0.9780 and -0.9705, respectively, P<0.05). Conclusion Curcumin can significantly inhibit the proliferation of U2OS 20S cells in vitro. Curcumin could provide a novel method in the clinical therapy for human osteosarcoma.
KEY WORDS: curcumin; osteosarcoma cells; proliferation
骨肉瘤(osteosarcoma)是高度恶性的间叶组织肿瘤,好发于儿童及青少年,约占原发恶性骨肿瘤的1/3,其发生率仅次于多发骨髓瘤[1]。国内外大量研究表明,姜黄素能抑制多种体外培养的肿瘤细胞如前列腺癌[2]、鼻咽癌[3]、肝癌[4]、胃癌[5]、结肠癌[6]等的生长及增殖,并诱导其凋亡,但姜黄素对人骨肉瘤细胞的作用尚未见报道。据此,为探索姜黄素对人骨肉瘤细胞的作用,我们采用体外实验方法,观察不同浓度、不同时间姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响,为临床骨肉瘤的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人骨肉瘤U2OS细胞株(中国科学院细胞库提供);RPMI1640培养基(Gibco公司); DHanks液、HEPES(Sigma公司,美国);胰蛋白酶(Gibocal公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(四季青公司,杭州);Hoechst33258(碧云天生物技术研究所); MTT(AMRESCO 公司,美国); DMSO、PBS(上海申工生物工程技术服务有限公司);姜黄素(Sigma公司,美国);Lambda Bio 10型分光光度计(Perkin Elmer公司);荧光显微镜(Olympus公司);CK2型倒置光学显微镜(Olympus公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 人骨肉瘤U2OS细胞的培养
将骨肉瘤细胞株U2OS冻存管从液氮中取出, 迅速置于37℃的恒温水槽中,不断搅动使管内冻存物在1min内融化。 将细胞悬液吸移至离心管中,1000g离心10min。弃上清,加入含100mL/L灭活胎牛血清的RPMI1640完全培养液,吹打均匀,1000g离心10min。弃上清,加适量培养液,吹打均匀。将细胞移至100mL细胞培养瓶中,反复吹打均匀,于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养,次日观察生长情况。待细胞均匀贴壁长满后,弃上层培养液,经2.5g/L胰酶消化后,加适量培养液稀释,反复吹打均匀。将部分细胞移入另一新培养瓶中,加适量培养液,置37℃、50mL/L CO2孵箱中继续传代培养。传代扩增后,将部分细胞冻存,以备随时复苏使用。
1.2.2 实验分组
将传代细胞随机分对照组(细胞不予姜黄素处理)、实验组(姜黄素 10、20、40μmol/L组)。
1.2.3 MTT比色法测定U2OS细胞增殖
取处于对数生长期的U2OS细胞,弃培养液后,用含100mL/L灭活胎牛血清的RPMI1640完全培养液配成单个细胞悬液,细胞计数后以每孔3×104个/mL接种于96孔培养板中,每孔100μL。待细胞培养至60%~80%融合时,换液。实验组分别加入浓度为10、20、40μmol/L的姜黄素,对照组仅加入生理盐水,每孔100μL,每组设3个平行对照。分别于培养结束前4h加入MTT 20μL/孔。于第12h、24h、48h结束培养,弃去上清,加入DMSO 150μL,于37℃空气浴振荡使结晶物充分溶解后,将96孔板放入酶标仪,以空白孔调零,测定各孔吸光度值(A490)。
1.4 统计学分析
数据用±s 表示,全部数据经统计软件SPSS11.5及Microsoft Excel处理。采用重复测量设计的方差分析评价各组之间及个时间点上的变化,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),相关分析采用直线相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 姜黄素对U2OS细胞生长状态的影响
在倒置显微镜下,对照组U2OS细胞成簇生长(图1A),细胞大小基本一致,呈圆形或椭圆形,折光性较弱;而实验组经姜黄素处理后,特别是20μmol/L和40μmol/L作用48h后,细胞数量明显减少,细胞体积大小不一,部分细胞体积明显缩小,轮廓不规则,折光性增强(图1B、图1C)。
2.2 姜黄素对U2OS细胞增殖的影响
10μmol/L姜黄素作用12h,仅轻度抑制U2OS细胞增殖(P>0.05),作用24或48h能明显抑制细胞增殖(P<0.05)。20 、40μmol/L姜黄素与人骨肉瘤U2OS细胞孵育12、24、48h,均可显著抑制细胞增殖(P<0.05),且随着作用时间延长,抑制作用更明显(P<0.05)。线性相关分析显示,姜黄素浓度愈高,对U2OS细胞的抑制作用愈强(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的r值分别为-0.9638、-0.9778、-0.9764,P均<0.05);姜黄素作用时间愈长,对U2OS细胞的抑制作用也愈明显(12h、24h、48h的r值分别为-0.9325、-0.9780、-0.9705,P均<0.05)(表1)。表1 姜黄素对U2OS细胞增殖抑制的时效与量效关系(略)
3 讨 论
姜黄素是一类多效的天然活性物质,具有较强的抗肿瘤活性。最近大量的研究表明,姜黄素对多种肿瘤细胞系具有明显抑制生长并诱导其凋亡的作用。HOLY等[7]报道姜黄素处理人乳腺癌MCF7细胞24~48h,细胞出现M期停滞,48h之后离开M期,细胞形成多个微核而不是正常的子核,作者认为姜黄素引起的G2/M停滞和这种细胞核的异常装配有关。SQUIRES等[8]报道姜黄素通过对S/G2/M细胞周期的影响而抑制人乳腺癌细胞HBL100和MDAMB468的增殖。车艺等[9]报道姜黄素可抑制急性髓性白血病细胞(HL60)的生长,其抑瘤率与药物浓度和作用时间呈依赖关系;姜黄素还能干扰细胞周期进程,诱导HL60细胞凋亡,其机制可能与凋亡因子调控G1/S和G2/M期检测点功能有关。梁华茂等[10]研究表明,姜黄素还可明显抑制人卵巢癌细胞株3AO的生长,并将肿瘤细胞聚集在S期和G2/M期。田慧军等[11]用不同浓度姜黄素处理结肠癌SW480细胞6~48h后, FCM结果显示细胞周期中G0/G1期细胞比例增加,S期、G2/M期比例下降。朱青等[12]用姜黄素处理HepG2细胞,流式细胞仪检测凋亡率为11.7% ,细胞停滞在G1和G2期。郭辉等[13]用不同浓度的姜黄素对雄激素依赖性及雄激素非依赖性前列腺癌细胞株LNCaP和PC3进行干预,结果两种前列腺癌细胞阻滞于G2、M期,从而诱导肿瘤细胞凋亡。刘立民等[14]用姜黄素处理人前列腺癌PC3m细胞,流式细胞术显示,停滞在S、G2/M期细胞增加,而G0/G1期细胞减少。VAN ERK等[15]研究指出姜黄素可使结肠癌HT29细胞周期中止于G2/M期。我们的研究发现, 10μmol/L姜黄素与人骨肉瘤U2OS细胞孵育24h以上时,能明显抑制U2OS细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖效应,说明姜黄素可抑制人骨肉瘤U2OS细胞的体外增殖。由于姜黄素具有来源广泛、价格低廉、无毒副作用等优点,作为一种抗致突变剂和抗促癌剂,将具有良好的前景。
【参考文献】
[1]FERRARI S, PALMERINI E. Adjuvant and neoadjuvant combination chemotherapy for osteogenic sarcoma [J]. Curr Opin Oncol, 2007,19(4):341346.
[2]VON LW EC, PERABO FG, SIENER R, et al. Review. Facts and fiction of phytotherapy for prostate cancer: a critical assessment of preclinical and clinical data [J]. In Vivo, 2007, 21(2):189204.
[3]姚运红,余健华,熊晖. 姜黄素体内外对鼻咽癌的抗癌作用 [J]. 肿瘤防治研究, 2006, 33(7):487489.
[4]厉红元,车艺,汤为学. 姜黄素对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响 [J]. 中华肝脏病杂志, 2002, 10(6):449451.
[5]MORAGODA L, JASZEWSKI R, MAJUMDAR AP. Curcumin induced modulation of cell cycle and apoptosis in gastric and colon cancer cells [J]. Anticancer Res, 2001, 21(2A):873878.
[6]范慧珍,范钰,许则丰. 姜黄素对结肠癌HCT116细胞侵袭和抗失巢凋亡的影响 [J]. 医药世界, 2006, 11(1):113115.
[7]HOLY JM. Curcumin disrupts mitotic spindle structure and induces micronucleation in MCF7 breast cancer cells [J]. Mutat Res, 2002, 518(1):7184.
[8]SQUIRES MS, HUDSON EA, HOWELLS L, et al. Relevance of mitogen activated protein kinase (MAPK) and phosphotidylinositol3 kinase/ protein kinase B (PI3K/PKB) pathways to induction of apoptosis by curcumin in breast cells [J]. Biochem Pharmacol, 2003, 65(3):361376.
[9]车艺,汤为学,郑维萍. 姜黄素对人急性髓性白血病细胞的作用及机理的初步探讨 [J]. 华西医科大学学报, 2002, 33(4):570572.
[10]梁华茂,姜洁,孔北华,等. γ干扰素对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖的影响 [J]. 山东大学学报(医学版), 2002, 40(4):307309.
[11]田慧军,王笛乐. 姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl2表达相关性研究 [J]. 肿瘤防治研究, 2006, 33(3):185187.
[12]朱青,张王刚,刘苏虎,等. 姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究 [J]. 陕西医学杂志, 2005, 34(10):11851186.
[13]郭辉,余建华,谌科,等. 姜黄素对前列腺癌细胞核转录因子抑制蛋白表达的影响 [J]. 中华外科杂志, 2006, 44(18):12561259.
[14]刘立民,孔祥波,常喜华. 姜黄素对前列腺癌PC3m细胞生长抑制和凋亡的影响 [J]. 吉林大学学报(医学版), 2007, 33(2):283285.
[15]VAN ERK MJ, TEULING E, STAAL YC, et al. Time and dosedependent effects of curcumin on gene expression in human colon cancer cells [J]. J Carcinog, 2004, 3(1):8.