脱钙骨/聚乳酸重组人工骨的研制及动物安全性评价

　　作者：刘金标,马泽辉,邓冰,潘显明,廖冬发　　作者单位：成都军区总医院骨科，四川 成都 610083

　　【摘要】 目的 研制性能优良的人工骨材料，评价其相关物理性能及动物安全性。方法 将脱钙骨、聚乳酸、氯化钠按比例复合，利用模压增强法制备重组人工骨(BPCB)材料，检测其孔隙率、孔径、生物力学强度等性能参数，并对材料进行动物安全性评价。结果 研制的BPCB材料孔隙率为55.20%、孔径为227.33μm、压缩强度为5.52MPa、弯曲强度为19.61MPa;全身急性毒性实验显示动物在注射浸提液后，没有任何不健康行为;热原实验结果显示在每种材料初试的新西兰白兔中，体温升高均在0.2℃以下，并且体温升高总度数在1.0℃以下，符合热原实验的评价标准;溶血实验结果显示溶血率为0.335%，不大于5%，符合医用材料的溶血实验要求。结论 BPCB材料的孔隙率、孔径、生物力学强度等性能均符合骨替代材料的要求，并且具备基本的动物安全性。

　　【关键词】 骨替代材料;人工骨;脱钙骨;聚乳酸;生物相容性

　　研制和寻找理想的骨替代材料，一直是医学和生物材料科学领域的一项重要课题。以往，我们曾经利用自行设计的“模压增强法”将珍珠层和聚乳酸两种材料组合，制备出珍珠层/聚乳酸重组人工骨[1,2,3]。多年来，脱钙骨(demineralized bone)和聚乳酸(polylactic acid)作为两种性能优良的骨替代材料一直受到众多研究者的重视[4,5]。为此，我们利用“模压增强法”将脱钙骨和聚乳酸进行重组，制备出脱钙骨/聚乳酸重组人工骨(demineralized bone /polylactic acid composite artificial bone,简称 BPCB)，检测其相关性能，并对该材料的生物相容性和安全性进行评价。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与实验动物

　　1.1.1 聚乳酸为外消旋聚乳酸(DL PLA)，由中山大学高分子研究所提供，相对分子质量为210000;脱钙骨为人脱钙骨,由南方医科大学附属南方医院骨科骨库提供，粉碎至直径80μm以下。

　　1.1.2 实验动物为成年雌性无孕新西兰白兔6只，体质量2.5～3.0kg，由四川省实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 BPCB的制备

　　脱钙骨∶聚乳酸∶氯化钠=1∶1∶2(质量比)，其中脱钙骨与聚乳酸为BPCB的构成成分，氯化钠为致孔剂，氯化钠晶体颗粒大小为150～200μm。材料分别经环氧乙烷消毒处理，在无菌环境中进行以下加工程序:(1)有机溶剂注模：按配方将定量的聚乳酸加入到三氯甲烷中，密封静置12h，配成浓度为20%的溶液。将脱钙骨粉和氯化钠混匀后，加入到聚乳酸溶液中，充分搅拌1h，直至肉眼见脱钙骨和氯化钠均匀分散于聚乳酸溶液中，此时混合物呈凝胶状。将此混合物倾注于成型模具中，置于37℃恒温鼓风干燥箱内任三氯甲烷挥发12h，混合物自行固化。(2)控温模压塑形：将固化的多孔块状混合物置于特制的塑形模具内，加热至55～65℃，对材料加压至10MPa以上，由于此时混合物中的聚乳酸软化，材料得以压紧并重新塑形。待模具完全冷却后，解除压力，取出材料。(3)颗粒沥滤致孔：将塑形后的材料浸泡于1000 ml双蒸水中，每6h更换双蒸水1次，直至材料中的氯化钠完全溶解 (浸泡液中滴加硝酸银试剂，不产生白色的氯化银沉淀)为止。材料经干燥后即为成品BPCB。

　　1.2.2 BPCB的性能检测

　　(1)孔隙率的检测 采用比重法，在30℃条件下测定：选用一个比重瓶，加满无水乙醇并称质量(M1);把质量为Ms的样品浸入乙醇中，抽真空，使样品中的气体完全被乙醇取代，待比重瓶补满乙醇后称质量(M2);将浸透了乙醇的样品取出，称剩余的乙醇与比重瓶的质量(M3)。按公式ε=(M2-M3-Ms)/(M1-M3)×100%计算材料的孔隙率;(2)孔径的检测 对材料的横断面进行电镜扫描，每个样品随机取3个视野拍照，逐个测量照片上孔隙的孔径，计算出样品的平均孔径;(3)生物力学强度的检测 在SWD10材料试验机上进行压缩试验和三点折弯试验，测试并计算出BPCB材料的最大压缩强度和弯曲强度值。

　　1.2.3 BPCB的动物安全性评价实验

　　1.2.3.1 急性毒性实验

　　选择健康新西兰兔3只，将BPCB浸提液通过耳缘静脉注射到动物体内，观察其精神、饮食、排泄等生物学反应。

　　1.2.3.2 热原实验

　　经体温筛选合格的新西兰兔共3只，测定其正常体温后15min内，将BPCB浸提液自耳缘静脉缓慢注入，剂量为10ml/kg，液体温度为37℃。注射后每隔1h测量体温1次，共测3次，以3次中体温最高的一次减去正常体温，即为该兔的体温升高度数。

　　1.2.3.3 溶血实验

　　实验分3组，分别为BPCB浸提液、生理盐水阴性对照组、双蒸水阳性对照组，每组各3管，每管分别加入相应液体10ml;另设空白对照管1管，加入生理盐水10ml。置37℃水浴中预热30min后，除空白管外，其余9管每管加稀释抗凝兔血0.2ml，轻轻混匀后置37℃水浴中继续保温60min。离心吸取上清夜，紫外分光光度计在545nm下测定吸光度。溶血率=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)。

　　1.2.4 数据处理

　　采用SPSS10.0统计软件分析，BPCB的各种性能参数及吸光度值直接通过样本值求算术均数及标准差。

　　2 结 果

　　2.1 BPCB的外观

　　采用模压增强法制备的BPCB材料因塑形模具的不同可压模成圆柱状、条状、块状等，材料外观呈黄褐色，质地较松脆，表面粗糙并有少量脱屑，肉眼可见表面密布微细的孔隙。(图1)

　　2.2 BPCB的主要性能参数

　　电子显微镜下见BPCB的横断面孔隙稍欠均匀，孔径大小在150～350μm之间，孔隙间相互交通，孔壁上可见大量数微米的微孔。6个BPCB的平均材料孔隙率为(55.20±4.48)%、孔径为(227.33±9.93)μm、压缩强度为(5.52±1.29)MPa、弯曲强度为(19.61±2.74)MPa。

　　2.3 BPCB的动物安全性实验

　　2.3.1 急性毒性实验

　　BPCB浸提液经静脉注射入实验动物体内后，所有动物均无死亡、惊厥、瘫痪、呼吸抑制等不良反应，动物精神正常，无不安、焦躁、萎靡不振等不健康行为，动物进食、排泄均与注射前无明显变化。

　　2.3.2 热原实验

　　实验动物在实验前体温均符合体温筛选要求，注射BPCB浸提液后体温变化情况见表1。表1 注射BPCB浸提液后兔体温变化(略)

　　2.3.3 溶血实验

　　溶血实验结果见表2，溶血率为0.335%，不大于5%，符合医用材料的溶血实验要求。表2 稀释抗凝兔血在BPCB浸提液中的溶血率(略)

　　3 讨 论

　　3.1 BPCB的构成成分

　　骨替代材料按其来源可分为人工材料和天然材料两大类。单一成分的材料由于难以同时满足生物相容性、成骨能力、降解速度、机械强度等诸多方面的要求，其应用范围十分局限。目前的研究普遍倾向于将不同特点的材料组合在一起，达到材料间优势互补的目的。脱钙骨是临床上常用的骨移植材料，它的主要成分是骨胶原，作为骨组织的基本成分之一，它较易被宿主组织吸收或爬行替代[6]。目前国内外研究者对脱钙骨的制备、贮存、使用等已积累了大量经验，经过处理后的脱钙骨免疫原性大大降低，植入人体后无明显的免疫排异反应[7]。由于具有肯定的疗效，脱钙骨在临床治疗中广泛应用[8]，特别是近年来脱钙骨与各种骨生长因子复合后显示出良好的骨诱导和骨传导作用，使得脱钙骨进一步为众多研究者所重视。聚乳酸是由丙交酯单体在一定条件下聚合而成的高分子聚合物，是最早获得美国食品和药物管理署(FDA)认可而用于临床的有机高分子材料之一[9]，被广泛用作可吸收内固定器、药物缓释载体、软骨和骨缺损修复材料等。聚乳酸可以在体内进行完全的生物降解，其降解产物可进入人体的正常代谢途径并最终转化为CO2和水，此外，聚乳酸能溶于有机溶剂，具有较好的机械强度和热塑性能。

　　脱钙骨是来自人体的天然有机材料，聚乳酸是人工合成的有机材料，两种材料不仅生物相容性良好，而且来源十分广泛。通过特定的工艺将这两种材料组合在一起后，利用聚乳酸良好的机械强度和热塑性能，可以赋予重组材料适宜的机械强度，并可根据需要任意塑形;另一方面，脱钙骨良好的亲水性可以改善聚乳酸亲水性不足的缺陷，有利于成骨细胞在材料表面的吸附与增殖，同时脱钙骨有利于材料与骨生长因子的复合，使材料具有骨诱导性能[10]。

　　3.2 BPCB的性能

　　骨替代材料的三维结构是决定材料与宿主骨结合速度和完成程度的主要因素之一。具有适宜孔隙结构的材料有利于新生血管组织的长入，提高新骨生成的速度和数量。我们制备的BPCB材料的孔隙率达55.20%，为新骨组织的长入提供了足够的空间，同时，其压缩强度和弯曲强度虽不及人体皮质骨，却接近正常松质骨的强度，完全可以满足非承重部位骨缺损填充的要求。

　　由于材料种类和实验方法的差异，各研究者对于骨替代材料的适宜孔径的看法并不一致。目前被大多数研究者接受的观点是：除某些降解特别迅速的材料外，骨替代材料的孔径不宜小于100μm，否则不利于骨组织的长入;另一方面，过大的孔径(>500μm)则会影响材料强度和细胞的粘附，也不利于新骨组织的形成。我们研制的BPCB材料的平均孔径为227.33μm，孔径大小适中，而且材料内部孔隙分布均匀，孔隙之间相互连通，有利于新生组织的长入。

　　3.3 BPCB的动物安全性

　　根据国际标准化组织(ISO)及中国卫生部的规定，对长期植入机体的材料，必须进行生物相容性评价。即使是符合要求的材料，当其原料配方、化学组成和制备过程有一定改变时，也需重新进行生物学评价。本研究急性毒性实验结果显示BPCB浸提液的注射对实验动物的精神、饮食、排泄等方面几乎未造成任何影响，更没有直接影响到动物的生存;热原实验结果显示3只新西兰白兔体温升高均在0.2℃以下，并且体温升高总度数在1.0℃以下，符合热原实验的评价标准;溶血实验结果显示溶血率为0.335%，符合医用材料的溶血实验要求。上述结果说明，尽管BPCB的制备过程使用了三氯甲烷等有机物质，但是由于经过了在恒温鼓风干燥箱内挥发、双蒸水反复浸泡萃取等步骤，加工过程中使用或产生的有害物质得到了完全清除，最终所制备的BPCB材料无毒性物质存在，无所含热原均符合生物体的要求，无溶血性，具有良好的生物相容性。

　　综上所述，BPCB的制备原材料生物相容性好，各成分间互补性强，材料的孔隙率、孔径、生物力学强度等性能都符合骨组织生长的要求，成品材料无毒性，无热原性，无热原性，具有良好的生物相容性，具备了优良人工骨材料的基本特点。当然，至于该材料植入体内后的实际效果如何，尚待作进一步的动物实验及临床研究。

　　【参考文献】

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