瑞舒伐他汀抑制激素诱导的人骨髓间充质干细胞成脂分化

　　作者：杨祖清　余国荣　施永彦　李安军 作者单位：430071　武汉大学中南医院骨科(杨祖清、余国荣);湖北医药学院附属人民医院骨科(杨祖清、施永彦、李安军)

　　【摘要】 目的　探讨不同浓度的瑞舒伐他汀对激素诱导的人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成脂分化的影响。方法　体外分离培养人BMMSCs，随机将细胞分为对照组、模型组、实验组(分为瑞舒伐他汀低、中、高浓度3个干预组)。模型组和实验组加入10-7mol/L地塞米松培养，第15天两组停加地塞米松，然后实验组加入不同浓度的瑞舒伐他汀干预。行油红O染色及定量分析、细胞内TG含量及ALP活性测定。结果　模型组细胞内TG含量明显增加，与对照组比较有统计学意义(P<0.01);模型组细胞内ALP活性增加，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。低浓度组细胞内TG含量和ALP活性略有增高，与模型组比较无统计学意义(P>0.05);中浓度组细胞内TG含量降低，ALP活性增高，与模型组比较有统计学意义(P<0.05);高浓度组细胞内TG含量明显降低，ALP活性显著增高，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)。结论　一定浓度的瑞舒伐他汀(≥10-7 mol/L)能抑制激素诱导的人BMMSCs的成脂分化过程，并有促进其成骨分化的作用。

　　【关键词】 间质干细胞;　骨髓祖代细胞;　地塞米松;　成脂分化;　瑞舒伐他汀

　　股骨头坏死可导致髋关节疼痛和功能障碍，重者造成终身残疾，丧失生活自理能力[1]。肾上腺糖皮质激素(简称激素)引起的骨质疏松所导致的股骨头缺血性坏死占非创伤性骨坏死的首位，致残率高，目前认为激素引起的脂质代谢紊乱，与骨质疏松及激素性股骨头坏死的关系密切，但缺乏能逆转骨坏死病理变化进程的理想方法[2-3]。近年来，动物实验表明，辛伐他汀能抑制激素诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的成脂分化、促进成骨分化过程[4-5]。本实验通过原代培养人BMMSCs，给予地塞米松诱导其向脂肪细胞分化，研究他汀类新药瑞舒伐他汀对地塞米松诱导的人BMMSCs成脂分化的影响，从而探讨瑞舒伐他汀预防和治疗激素引起的骨质疏松及股骨头坏死的可能性。

　　一、对象与方法

　　1. 对象：选取湖北医药学院附属人民医院骨科8例下肢骨折行髓内钉固定扩髓者，均为无骨代谢疾病的健康成人，且同意提供骨髓。其中男6例，女2例，年龄22～43岁。

　　2. 材料：DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季生物材料有限公司)，地塞米松(美国Sigma公司)，瑞舒伐他汀(美国默克-杭州默沙东公司)，油红O(美国Ameresco公司)，TG检测试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(上海科华东菱诊断用品有限公司);主要仪器：CO2 培养箱(美国Thermo Forma公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，全自动生化分析仪(日立7600-020型，日本日立公司)。

　　3. 人BMMSCs的分离与培养：采用全骨髓贴壁分离法，具体步骤参考文献[6]。

　　4. 人BMMSCs的成脂分化及瑞舒伐他汀的干预过程：取人BMMSCs细胞培养7 d，以3×104/cm2接种于6孔培养板内，随机将细胞分为对照组、模型组、实验组。实验组再分3个亚组(即瑞舒伐他汀低、中、高浓度干预组)。对照组不加地塞米松和瑞舒伐他汀干预，每孔加入2 ml 含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，模型组和实验组加入浓度为10-7mol/L的地塞米松液干预细胞，培养第15天停加地塞米松，实验组分别用低浓度(10-8mol/L)、中浓度(10-7mol/L)、高浓度(10-6mol/L)的瑞舒伐他汀干预。每例标本培养对照组2板，模型组2板，每浓度组各2板。23 d后终止培养。以上重复三次。

　　5. 油红O、苏木素染色：培养第21天，弃孔板内培养基，PBS漂洗细胞，每孔加入 10%的甲醛磷酸盐缓冲液2 ml，固定30 min，漂洗细胞，加油红O染色液2 ml，染色35 min，双蒸水漂洗细胞3遍后，每孔再加入苏木素染色液2 ml，室温染色40 s，双蒸水漂洗，照相。红染细胞为阳性细胞，挑选阳性细胞最多的部位，在×100的放大倍数下随机采集20个视野，利用Image pro-plus 6.0软件，计算每个视野下阳性细胞的总面积。

　　6. 细胞内TG含量测定：培养第23天，吸弃培养液，每孔加入DMEM/F12培养基1 ml，用细胞刮器收集细胞，用氯仿∶甲醇(2∶1)混合液抽提5 min，将有机相37 ℃水浴，使甲醇、氯仿挥发后，用TG试剂盒在全自动生化分析仪上测定TG含量。

　　7. ALP活性测定：培养第23天，吸弃培养液，每孔加入DMEM/F12培养基1 ml，用细胞刮器收集细胞，置入200 μl EP管中，加入100 μl PBS，反复冻融裂解细胞，3000 r/min离心10 min，取上清液，用ALP试剂盒在全自动生化分析仪上测定细胞内ALP活性。

　　8. 统计学处理：所得数据用均数±标准差(x-±s)表示，用SPSS 13.0统计软件包处理分析，组间比较采用方差分析，其中两两比较用SNK-q检验，以α=0.05为检验水准，P< 0.05为差异具有统计学意义。

　　二、结果

　　1. 原代培养人BMMSCs：人BMMSCs刚接种时，有较多的小圆形细胞悬浮。8～10 h后开始贴壁，培养24 h后大部分小圆形细胞变为贴壁的梭形、多角形，细胞散在，数目不多。随着培养天数增加，细胞数目逐渐增多，细胞体积增大，第10天大量细胞呈单层融合，细胞长梭形紧密排列，呈漩涡状。传代后的细胞3～4 h 贴壁，1 d后出现多个突起，多角形、梭形混杂(图1)。

　　2. 油红 O 染色及定量结果：10-7mol/L的地塞米松诱导细胞3 d，细胞变大、变圆，部分细胞内出现单个脂滴。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，细胞内出现多个脂滴。培养第21天，模型组90%以上细胞充满脂滴，红染细胞数多，染色面积大(图2)。低浓度组在红染细胞数和红染面积与模型组比较差异无统计学意义;中浓度组红染细胞数有所减少，染色面积有所缩小，差异有统计学意义(P<0.05);高剂量组红染细胞数目显著减少，红染面积明显下降(图3)，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

　　3. 细胞内TG含量、ALP活性测定：模型组人BMMSCs内TG含量明显增加，与对照组比较有统计学意义(P<0.01)，ALP活性增加，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。实验组用10-8mol/L的瑞舒伐他汀作用于激素诱导的人BMMSCs，TG含量和ALP活性略有增高，与模型组比较无统计学意义;表明其对激素诱导的人BMMSCs的成脂过程无明显抑制作用，当瑞舒伐他汀浓度达到10-7mol/L时，TG含量开始降低，ALP活性开始增高，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)，表明其对激素诱导的人BMMSCs的成脂过程被抑制;瑞舒伐他汀浓度继续增加到10-6mol/L时，TG含量明显降低，ALP活性显著增高，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，表明其成脂过程的抑制作用明显加强(P<0.01)，并有促进其成骨分化的作用(见表2)。表1　不同浓度瑞舒伐他汀作用于激素诱导的人BMMSCs的油红O染色及定量结果表2　不同浓度瑞舒伐他汀对激素诱导的人BMMSCs内TG含量及ALP活性的影响

　　三、讨论

　　BMMSCs作为多潜能干细胞，在体外培养时能够分化成各系定向祖细胞，进而再分化为成纤维细胞、网状细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等支持造血微环境所必需的多种细胞。正常生理情况下，BMMSCs主要分化为成骨细胞和骨细胞，几乎不发生脂肪转变[7]。在不同的培养条件下，其终末分化途径不同，BMMSCs在成骨细胞与脂肪细胞分化之间呈反向变化[8]。

　　激素所引起的骨质疏松和股骨头坏死的发病机制是学术界争论焦点，目前尚无定论。主要有血液高黏滞状态学说、脂代谢紊乱学说、骨内高压学说、血管内凝血学说、激素直接诱导学说等，其中脂代谢紊乱学说受到许多学者的重视和接受[9]。认为激素可改变体内脂肪代谢和成骨代谢，从而引起的骨质疏松和股骨头坏死。有研究发现，地塞米松在诱导BMMSCs分化的过程中，其向脂肪细胞分化与向成骨细胞分化的趋势是不同的[10]。低浓度的地塞米松作用于BMMSCs，既向脂肪细胞分化，又向成骨细胞分化，但当地塞米松浓度超过10-7mol/L后，BMMSCs成脂分化过程显著增强，并明显抑制其成骨分化过程。所以本研究采用10-7mol/L作为地塞米松成脂诱导的惟一浓度。

　　TG作为体外细胞成脂分化相关表型标记指标并无异议，而ALP作为成骨细胞的一种特异表型，其确切作用目前尚不完全清楚。在成骨细胞的分化过程中，成骨细胞的前体细胞和成熟的成骨细胞开始出现ALP，但在骨细胞中ALP又消失。一般认为，在骨细胞群中ALP活性增高提示细胞的高分化状态。ALP与成骨细胞的分化有关。因此ALP活性增高在体外实验中作为成骨细胞分化的指标[11-12]。

　　他汀类药物是竞争性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，能够降低肝内胆固醇的生物合成，是近20年来发展起来的一类降脂药，目前广泛用于治疗高脂血症。有研究报道他汀类药物可以治疗骨质疏松并能促进骨形成[13]。国外众学者的研究亦提示：成脂相关基因(422aP2基因、PPARγ2 基因等)和相关表型标记指标(如TG含量) 表达水平降低，而成骨相关基因(Ⅰ型胶原蛋白基因、骨钙素基因、BMP-2基因等)表达水平升高，成骨相关表型标记指标(如ALP活性)发生相应增高改变，从而推测其是治疗骨坏死和骨质疏松症的最佳候选药物[13-15]，在体内能降低血脂水平，降低骨坏死的发生率，具有对抗激素而达到保护骨的作用。

　　研究还发现不同浓度的他汀类药物对骨代谢作用亦有差异[12,16]。洛伐他汀和普伐他汀作用较小，辛伐他汀和阿托伐他汀作用较大[13]。有学者认为洛伐他汀可降低BMMSCs系成脂过程中PPARγ2 的表达[17]，也有学者发现辛伐他汀可抑制大鼠BMMSCs中LPL表达，从而抑制成脂化[12]。以往的实验常使用动物的BMMSCs，与人类的BMMSCs有一定差异。本实验采用了瑞舒伐他汀作用于人BMMSCs，瑞舒伐他汀是新一代HMG-CoA还原酶抑制剂，与其他的他汀药物比较，具有更强效应及更好的安全性和耐受性。本实验观察到随着瑞舒伐他汀干预浓度的增加，激素诱导的人BMMSCs内 TG含量逐渐减少，ALP活性逐渐增加，有利于人BMMSCs的成骨化。

　　本实验初步观察了一定浓度的瑞舒伐他汀对激素诱导的人BMMSCs成脂化抑制作用及成骨化促进作用，表明瑞舒伐他汀对大量激素导致的骨质疏松及股骨头坏死的预防和治疗可能起到重要作用。本研究对人BMMSCs成脂化、成骨化的相关基因表达水平及转录过程未作深入研究，有待进一步研究，将更有利于激素性骨质疏松及股骨头坏死的预防和治疗。

　　(本文图片见光盘)

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