人正常和退变腰椎间盘中TIMP1的表达及其意义
发表时间：2012-03-09 浏览次数：427次
作者：孔杰 作者单位：青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东 青岛 266003
【摘要】 目的 探讨金属蛋白酶组织抑制因子1 (TIMP1)mRNA在正常与退变椎间盘中表达的差别及意义。方法 利用荧光定量PCR技术检测TIMP1 mRNA在正常椎间盘(9个)与退变椎间盘(30个)组织的含量，结合年龄、病程、病理类型进行分析。结果 TIMP1在正常椎间盘组织表达量为0.900±0.289，退变椎间盘中TIMP1 mRNA表达量为0.340±0.241，两者差异有显著性(t=5.841,P<0.05)。退变椎间盘中，不同年龄、病程及病理类型组间TIMP1 mRNA的表达量差异无统计学意义。结论 TIMP1 mRNA 的含量下降在腰椎间盘退变过程中起着重要作用，但未见与年龄、病程及病理类型有明显的关系。
【关键词】 椎间盘 金属蛋白酶1组织抑制剂 人
EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE1 IN NORMAL AND DEGENERATIVE LUMBAR INTERVERTEBRAL DISC
KONG JIE, MA BIN, HU YOUGU, et al
Department of Spinal Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China
[ABSTRACT] Objective To study the expressions and their significance of tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in normal and degenerative lumbar intervertebral discs. Methods A realtime fluorescence quantitative RTPCR was used to detect the content of mRNA of TIMP1 in normal and degenerative lumbar intervertebral discs. The results were analyzed in conjunction with the age, history and pathological types. Results TIMP1 was expressed mostly largely in the normal discs, and less in the degenerative ones. No significant differences of expression of TIMP1 mRNA were noted in terms of the age, history and pathological types in the degenerative discs. Conclusion The decrease of TIMP1 plays an important role in the process of the disc degeneration, which has no obvious association with the age, history and pathological types.
[KEY WORDS] Intervertebral disc; Tissue inhibitor of metalloproteinase1; Persons
腰椎间盘突出症是引起腰腿痛的主要疾病之一。腰椎间盘突出的病理实质为腰椎间盘退变，其病理生物学基础为椎间盘基质合成和降解的失衡。基质金属蛋白酶(MMPs)为降解细胞外基质的重要细胞因子，而基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)则为MMPs的特异性拮抗剂。国内外研究结果显示，基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)在冠状动脉疾病、肺脏疾病、肠道肿瘤、肝细胞瘤中有多种生物学功能[1～4]，但是TIMP1在人正常和退变椎间盘髓核组织中的表达情况仍不清楚。本实验旨在探讨TIMP1 mRNA在正常与退变椎间盘中表达的差别及意义。
1 材料和方法
1.1 材料
RNA提取试剂TRNzol A+ (TIANGEN公司)，Takara荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物公司)，荧光定量PCR仪器(美国ABI公司7500 定量 PCR仪)。TIMP1和内参GAPDH的上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，荧光探针由大连宝生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 椎间盘的收集与分组
正常组：9个正常的椎间盘取自3名意外死亡的正常人，均为男性，年龄18～22岁，平均年龄20.33岁。退变组：30个退变椎间盘取自2006年8～10月青岛大学医学院附属医院脊柱外科因椎间盘突出症而手术的病人，男18例，女 12例，年龄24～72岁，平均年龄45.90岁。所有椎间盘髓核组织均在无菌条件下取出后迅速放于-80 ℃冰箱冻存。
1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成
采用TRNzol A+ RNA提取试剂按操作说明提取正常及退变椎间盘的总RNA，紫外线分光光度计测定A260的值以估算总RNA浓度，测定A260/280的值来检测RNA的纯度。用PrimeScriptTM RTReagent 试剂盒将mRNA反转录为cDNA。反应体系为：5×buffer 2 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL， Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 1 μg，加RNase Free dH2O 至总体积10 μL，将上述反应液混匀后置于37 ℃水浴中作用15 min后，置于85 ℃水浴中5 s，使酶灭活。
1.2.3 实时荧光定量PCR引物设计合成
TIMP1的引物序列，上游引物F: 5′GCTTCTGGCATCCTGTTGTTG3′;下游引物R: 5′CTTCTGGTGTCCCCACGAACT3′;Taqman探针:5′AGACGGCCTTCTGCAATTCCGACCT3′，扩增片段长度133 bp。内参GAPDH的引物序列，上游引物F: 5′CTTAGCACCCCTGGCCAAG3′;下游引物R: 5′GATGTTCTGGAGAGCCCCG3′; Taqman探针：5′CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA3′，扩增片段长度150 bp。
1.2.4 实时荧光定量PCR扩增
取样品在荧光定量PCR 仪上进行扩增。反应体系 Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL：PCR Forward Primer 0.8 μL， PCR Reverse Primer 0.8 μL，TaqMan探针0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL模板cDNA 2 μL， dH2O 5.2 μL。其反应条件为：95 ℃预变性10 s后，95 ℃ 5 s、 62 ℃ 45 s,共40个循环。
1.2.5 数据处理及统计学分析
采用相对定量法，在测定目的基因的同时测定内源性看家基因GAPDH，用以标准化样本。采用2-△△CT计算目的基因的相对表达量[5]。统计学分析△△CT=(CT,Target-CT,GAPDH)Time x-(CT,Target-CT,GAPDH)Time 0。CT值表示样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数，由荧光PCR仪在扩增过程中自动读出。应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。正常组与退变组以及不同病理类型之间比较采用两样本均数t检验。不同年龄间和不同病程间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 总RNA提取纯度及浓度检测
测得总RNA的A260的值为1.8～2.1，说明提取纯度较高，A260/280的值为0.5～1.0，说明提取浓度适中。
2.2 正常组与退变组TIMP1 mRNA含量的比较
正常组中TIMP1 mRNA的表达量为0.900±0.289，退变组的表达量为0.340±0.240，两组比较，退变组TIMP1的含量较正常组明显减少，差别具有统计学意义(t=5.841，P<0.05)。
2.3 不同年龄组TIMP1含量的比较
按不同年龄段将退变椎间盘分成4组，年龄<30岁组(n=3)表达量为0.247±0.216，30～40岁组(n=8)表达量为0.346±0.295，41～50岁组(n=11)表达量为0.439±0.260，年龄>50岁组(n=3)表达量为0.296±0.241，各年龄组间差别无统计学意义(F=1.113，P>0.05)。
2.4 不同病程组TIMP1含量的比较
按不同病程分成3组，病程<6个月组(n=9) 表达量为0.216±0.129，病程6～12个月组(n=12)表达量为0.342±0.179，病程>12个月组(n=9)表达量为0.276±0.145，各组间差异无统计学意义(F=1.718，P>0.05)。
2.5 不同病理类型组TIMP1含量的比较
依据术中所见将突出椎间盘分为2组，包含型组(n=5)表达量为0.377±0.144，突出游离型组(n=25)表达量为0.301±0.207，两组间差异无统计学意义(t=0.781，P>0.05)。
3 讨 论
椎间盘退变机制较复杂，其中椎间盘基质的合成与降解失衡是重要的病理基础，MMPs与TIMPs在椎间盘基质平衡中为重要的因素之一。MMPs是细胞外基质降解过程中主要细胞因子，几乎能够降解多糖以外的所有细胞外基质成分，它还可以激活其他MMPs产生连锁放大效应，而TIMP1则是MMPs的特异性和内源性抑制因子之一，可以非共价结合的方式与有活性的MMPs 1∶1稳定结合而发挥作用[6]。同时，TIMP1 还有抑制细胞凋亡，刺激增殖的作用[7]。
本实验通过对正常和退变椎间盘组织中TIMP1 mRNA含量的分析显示，与正常椎间盘相比，退变椎间盘组织中TIMP1 mRNA的含量明显下降，表明TIMP1对上述拮抗MMPs作用的影响减小，导致椎间盘退变。
在不同年龄组之间，年龄<30岁组TIMP1表达量较41～50岁组减少，表明在早期的椎间盘突出中，TIMP1的减少起着较大作用，而在中老年病人中，随着椎间盘细胞的凋亡及生物学活性的降低[8]，基质合成减少，同时TIMP1也失去了作用的靶细胞。由于年龄<30岁组样本量较少，未能得出统计学差别。
分析不同病程和病理类型与TIMP1 mRNA下降的关系，没有得出统计学上的差异，可能在椎间盘突出病人中，TIMP1下降与病程和病理类型无关。
由于所有退变的标本均来自于因腰椎间盘突出症而手术的病人，其椎间盘退变程度较重，故未能观察轻度退变时椎间盘中TIMP1 mRNA的含量，两者是否存在关联性仍有待于进一步研究。
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