降钙素基因相关肽与骨折愈合

　　作者：黄泰源　张光武 作者单位：100144　北京大学首钢医院骨科

　　【关键词】 降钙素基因相关肽 骨折 愈合

　　降钙素基因相关肽(CGRP)是神经肽家族的一员，主要由感觉神经合成与分泌，具有多种生理功能。研究证明，CGRP在骨组织正常代谢及骨折愈合过程中发挥着重要作用，其机制尚不清楚。本文复习了近年来相关研究报道，对骨组织中CGRP的分布、生物学特性及与骨折愈合相关细胞和因子的生理与病理生理学联系做一综述。

　　一、CGRP生物学特征及分布

　　CGRP是一类多功能的激素多肽，分为CGRP-α、CGRP-β两种亚型[1]。CGRP与降钙素(CT)均由CT基因编码，人的CGRP基因定位于11号染色体短臂1区2带，在1位、7位氨基酸之间有二硫键相连，C端有苯丙氨酸残基。CT基因由2800个碱基对组成，含5个内含子和6个外显子。它的表达具有组织特异性，如在甲状腺，转录产物为CT(为1、2、3、4外显子剪接);在神经组织，则为CGRP(为1、2、3、5、6外显子剪接)。CGRP的相对分子质量为3786.91，含有37个氨基酸残基[2]。CGRP主要来源于感觉神经纤维，由脊髓后根神经节神经元产生，通过轴浆运输到达神经末梢，以分泌颗粒的形式储存在胞浆中，随神经末梢广泛分布于周围器官[3](心血管、消化道、呼吸道、泌尿生殖系统、肝、皮肤、甲状腺、垂体及运动等器官和组织内)，发挥正性肌力作用、促进肝脏葡萄糖释放、抑制胃酸分泌等重要的生理功能。骨组织中，CGRP阳性神经纤维主要分布于成骨活性较高的区域，如干骺端、骨膜和髓腔，皮质骨内CGRP阳性神经纤维密度最低，骨骺的分布较骨干多[4]。

　　二、CGRP在骨组织修复中的作用

　　(一)临床与实验证据

　　多年来的研究证明，与骨组织代谢直接相关的骨髓基质细胞、成骨细胞、骨髓巨噬细胞、破骨细胞四种细胞表面均存在CGRP受体[5]。临床研究发现，在骨折患者的血浆中，CGRP浓度有明显增加，骨折局部CGRP阳性纤维也明显增加[6]。Lerner等[7]通过骨骼肌神经纤维的免疫组织化学表型鉴定证明，有限数目的神经肽包括CGRP、P物质、血管活性肠肽的表达与成骨过程有关。有研究证实，在大鼠胫骨骨折愈合过程中，CGRP阳性神经纤维大量出现于骨膜、纤维肉芽组织和新生骨组织中，且其增生程度随着骨形成及改建过程而有序地增减，这些增生的感觉神经纤维能于局部释放出远高于血清水平的CGRP，从而参与正常骨愈合过程[2]。此外，Hayashi等[8]发现脊髓损伤合并骨折大鼠血清CGRP早期表达明显增高，伤后7 d达正常3倍以上，伤后3 d、7 d与单纯骨折组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。Lerner[9]对小鼠作CGRP基因敲除，发现骨形成显著减少而骨吸收变化不大，进一步证实了CGRP与骨质代谢之间的相关性。

　　(二)CGRP与成骨细胞

　　Jimenez-Andrade等[10]采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法发现人成骨细胞表面有CGRP受体的mRNA表达，进而证实了成骨细胞CGRP受体的存在。Granholm等[11]在不同种属骨源性成骨细胞培养中发现，CGRP可以明显刺激成骨细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的产生，而cAMP水平的高低则与成骨细胞的分泌活性有关。另一组人员研究发现，CGRP能够调节成骨细胞内的Ca2+浓度，进而改变成骨细胞的活性，还可以明显刺激体外培养的人成骨细胞样细胞和鼠成骨细胞的cAMP水平，通过cAMP/PKA信号途径影响成骨细胞的代谢[12]。Villa等[13]通过体外实验以及受体抑制实验研究发现CGRP能够诱导原代培养的成骨样细胞增殖，且不能被特异性CGRP受体-1拮抗剂CGRP 8-37所阻滞，提示成骨细胞上存在CGRP受体的多种亚型且CGRP诱导的增殖效应是cAMP非依赖性的。Wang等[5]通过对CGRP作用的骨髓基质细胞(BMCs)5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入、PCR产物、碱性磷酸酶(ALP)活性以及矿化作用的分析发现，CGRP能够刺激骨髓基质细胞增殖、上调成骨性基因表达、增加ALP活性以及BMCs的矿化。Villa等[14]发现CGRP还可增强成骨细胞内蛋白激酶C(PKC)的活性，PKC是细胞内合成代谢反应中不可缺少的物质，进一步通过PKC激活剂与拮抗剂的对照处理，他们证明了PKC激活在CT、CGRP、Amylin对人成骨细胞的增殖作用中至关重要。Ballica等[15]进行CGRP转基因小鼠的体内研究，运用定量计算机体层摄影和组织形态测定法，发现小梁骨的骨密度和骨容积在转基因小鼠中都有提高，且主要归功于骨形成速率加快。Lerner[9]的CGRP基因敲除小鼠实验，显示CGRP基因敲除的小鼠骨形成显著减少而骨吸收变化不大，提示CGRP可能主要通过影响成骨细胞发挥对骨组织的调节作用。最新的细胞实验研究[16]发现，CGRP能够抑制成骨细胞的凋亡，且这种抗凋亡的作用可能与CGRP对成骨细胞Wnt通路的激活、β-catenin的细胞内表达与含量增加有关。CGRP如何参与到成骨细胞正常的代谢中及其发挥作用的具体机制仍有待于进一步的细致化的研究。

　　(三)CGRP与破骨细胞

　　Naot等[1]发现不同浓度CGRP均减少了体外培养的破骨细胞前体细胞的数量，成熟的破骨细胞数量也相应减少，并具有浓度依赖性。另一组研究者发现CGRP通过抑制破骨细胞祖细胞的分化和生成对破骨细胞起作用[17]。RANKL是破骨细胞前体增殖分化的两大关键因子之一，Wang等[5]发现在骨髓巨噬细胞培养基中，CGRP(10-8mol/L)抑制RANKL对NF-κB的激活作用，下调破骨化基因如酸性磷酸酶、组织蛋白酶K的表达，减少耐酒石酸的酸性磷酸酶阳性细胞的数量、抑制RANKL诱导的骨髓巨噬细胞的骨吸收活性。可见，CGRP既能以直接或间接的方式抑制成熟破骨细胞的活性，也能够减少破骨细胞前体的增殖及向破骨细胞的分化，从而发挥减少骨吸收的作用。

　　(四)CGRP与炎症相关细胞

　　从病理学角度，骨折愈合虽然是骨组织特异性修复的过程，本质上，仍然是机体在应对组织损伤性变化时发生的一种炎症反应。文献显示，CGRP与几种炎症相关细胞也存在着一定的功能联系。

　　1. CGRP与巨噬细胞：研究者发现巨噬细胞在细胞膜表面表达CRLR(CT受体样受体)及RAMP1(受体活性修饰蛋白1)(为CGRP受体复合物的两大组成部分)[18]。与CGRP不同的是，CT需要在RANKL诱导的前提下，才能表达CT受体[19]。CGRP能够增加巨噬细胞内髓样细胞触发受体-1(TREM-1)的mRNA以及蛋白质的表达，而TREM-1在调节固有免疫反应过程中起着关键作用[20]。20世纪90年代的研究揭示，CGRP可抑制内毒素(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞多种致炎因子的分泌(如抑制TNF-α和IL-12的产生)，双相调节IL-6的产生(小剂量促进大剂量抑制)，增加CXC趋化因子KC和巨噬细胞炎症蛋白-2以及增加一氧化氮和前列腺素的产生。此外，CGRP还被发现具有调节淋巴细胞分化的作用[21]。Ma等[22]通过酶联免疫吸附法研究认为单核/巨噬细胞是体内CGRP的重要来源，神经生长因子、前列腺素E、IL-1、IL-6、NF-κB都在CGRP的产生过程中起着重要作用，另一方面在炎症免疫反应中，CGRP对促炎因子以及抑炎因子也扮演着既促进又抑制的双重角色。

　　2. CGRP与成纤维细胞：有学者利用体外培养和原位杂交方法，观察到人牙周膜成纤维细胞呈CGRP受体-1阳性染色，受体定位于胞浆[23]。体外实验表明，P物质与CGRP刺激成纤维细胞内DNA的合成，具有浓度依赖性，且在一定范围内呈协同作用。最近的研究表明，CGRP能够诱导牙髓成纤维细胞多种生长因子的表达，包括HGF、PIGF以及bFGF，而成纤维细胞分泌的多种细胞因子对CGRP的释放也起到重要作用[24]。

　　3. CGRP与血管内皮细胞：CGRP受体是G蛋白偶联受体，存在于一些血管内皮细胞及平滑肌细胞表面。CGRP是已知最强的内源性扩血管物质，其舒张血管作用比乙酰胆碱、ATP、ADP、腺苷、5-HT和P物质等强10 000倍左右，比异丙肾上腺素强10～100倍。动物实验和临床应用均证明CGRP具有明显拮抗血管收缩剂的作用，包括5-HT、去甲肾上腺素(NE)、胆囊收缩素(CCK)和内皮素(ET)等，使处于收缩状态的血管扩张[25]。CGRP可促进内皮细胞的生长和内皮向受损血管壁的迁移。使用CGRP能促进组织内血管新生从而提高局部缺血组织的外科皮瓣的存活率[25]。

　　(五)CGRP与骨折愈合相关细胞因子

　　骨形成蛋白(BMP)是在骨基质中存在的一种骨诱导活性蛋白，有多种亚型，能诱导未分化的间充质细胞不可逆转化为软骨和骨。BMP主要在增生的骨膜、骨髓腔和骨折部位的肌肉3种细胞内表达，故以骨折断端的BMP浓度最高。Tsuji等[26]的实验证明，BMP-2在骨折愈合过程中是重要的必不可少的内源性介导因子。Bucelli等[27]研究发现多种BMP亚型均能够使背根神经节神经元胞体表达CGRP提高，最近的研究表明利用腺病毒转染过表达BMP-7能够特异性地诱导神经元CGRP表达增加[28]，相对应的，Northern 印迹法研究发现CGRP能够使骨髓培养液BMP-2的mRNA的表达提高1.8倍[29]。

　　成纤维细胞生长因子(FGF)是最早从牛脑垂体中提取的一种多肽，分为aFGF和bFGF两类。FGF的主要作用是促进成骨细胞增生，增加成骨细胞前体，并使其分化为成骨细胞以及刺激血管生成[30]。Rabie等[31]研究发现，bFGF可以通过上调血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达来促进移植骨的血管化从而促进新骨形成。CGRP能够诱导成纤维细胞bFGF的表达，从而间接推动骨折愈合[24]。

　　胰岛素样生长因子(IGF)由包括骨组织在内的许多组织产生，主要通过自分泌、旁分泌及沉积在骨基质中起作用。IGF分为：IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，其中IGF-Ⅱ又被称为骨骼生长因子(SGF)，主要由成骨细胞合成，是骨组织中含量最丰富的生长因子[32]。两者的生物学特性基本相同：IGF-Ⅰ的作用略强于IGF-Ⅱ。IGF主要通过刺激成骨细胞的分裂增殖来作用于骨的生长与修复过程，IGF可以促进成骨细胞合成胶原并防止胶原纤维的裂解[33]。Harada等[34]通过基因敲除及对照抑制实验，证明支配肝脏的感觉神经纤维释放CGRP能够诱导肝组织IGF-Ⅰ的产生，从而减少缺血再灌注大鼠的肝细胞凋亡及组织损伤。

　　总之，CGRP与骨折愈合有密切关联。通过对CGRP的研究，可以深化人们对骨折愈合理论、生物信息转导、神经内分泌等基础理论的认识，有助于提出干预、影响和促进骨折愈合的新理论、新方法、新思路。

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