退变颈椎间盘组织中细胞凋亡及死亡受体DR5表达的研究

　　作者：王庆锋,锁志刚,丁惠强　　作者单位：1.宁夏医科大学,银川 750004; 2.宁夏医科大学附属医院骨科，银川 750004

　　【摘要】目的 探讨死亡受体5(death receptor 5,DR5)在颈椎间盘退变中的作用。方法 采用原位DNA片段末端标记( TUNEL)法和免疫组织化学方法，对比观察30例颈椎病患者(实验组)及30例创伤患者(对照组)颈椎间盘组织细胞凋亡状态及死亡受体DR5的表达。结果 TUNEL染色显示实验组的髓核内平均凋亡细胞率为(10.93±1.87)%，高于对照组的(6.43±1.56)%(P<0.01)。免疫组织化学染色显示实验组的髓核内DR5阳性细胞率为(50.73±15.92)%，高于对照组的(41.23±16.35)%(P<0.05)。Pearson相关分析表明颈椎间盘髓核内DR5阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关(r=0.755，P<0.01)。结论 高水平的DR5表达参与了退变颈椎间盘髓核细胞的凋亡，由DR5/TRAIL诱导的凋亡途径可能在颈椎病颈椎间盘退行性变发生和发展中发挥作用。

　　【关键词】 颈椎间盘;退行性变;细胞凋亡;DR5

　　Expression of DR5 in the Pulpy Nucleus Tissue of Human Cervical Disc and the Apoptosis of Nuclei Pulposus　(1.Ningxia Med.Univ.,Yinchuan 750004; 2.Dept of Orthopedics,the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ.,Yinchuan 750004)

　　Abstract: Objective To explore the expression of death receptor 5(DR5) in degenerative cervical disc tissue.Methods The apoptotic status and the expression of DR5 were detected in 30 cases of degenerative cervical intervertebal disc tissues and 30 of traumatic normal cervical intervertebal disc tissues with TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling ( TUNEL) and immu- nohistochemistry methods.Results The positivity rate of TUNEL staining was significantly higher in patient group(10.93%±1.87%) than that in control group(6.43%±1.56%)(P<0.01).The positive expression rate of DR5 of nucleus pulposus in patient group(50.73%±15.92%) was significantly higher than that in control group (41.23%±16.35%) (P<0.05).When the total 60 specimens in the two groups were analyzed,the DR5 positive incidence of nucleus pulposus showed significant positive correlation with the TUNEL positive incidence of nucleus pulposus (r=0.755,P<0.01).Conclusion High levels of DR5 expression in degenerative cervical intervertebal disc tissues is involved in apoptosis.The apoptosis pathway induced by DR5/ tumor necrotic factor-related apoptosis-inducing ligand ( TRAIL) maybe play an important role in the occurrence and progression of cervical intervertebal disc degeneration.

　　Key words:cervical intervertebal disc; degeneration; apoptosis; DR5

　　目前公认颈椎病发生发展的根本原因是颈椎间盘退变,而椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关。有关退变椎间盘细胞凋亡机制研究表明，Fas介导的细胞凋亡途径参与了椎间盘退变[1-2],另有研究表明退变椎间盘中有TNFα-TNFR[3]和Trail-TrailR[4]的表达，但其与退变椎间盘细胞凋亡的关系报道较少。本研究采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)和免疫组织化学方法对30例颈椎病退变颈椎间盘组织及30例创伤对照颈椎间盘组织的细胞凋亡状态及髓核组织中Trail-R2，即死亡受体DR5的表达进行研究，探讨DR5/ TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)凋亡途径在颈椎间盘退变中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 取材及分组

　　颈椎间盘组织(C3-C7)取自2007年5月至2009年1月本院骨科。标本分为实验组和对照组。实验组标本来源于脊髓型颈椎病患者前路手术所取得的椎间盘组织,术后病理检查证实为退变椎间盘，患者共30例，男24例,女6例,年龄46～74岁;对照组标本来源于颈椎创伤患者前路手术所取得的椎间盘组织，术后病理检查证实为无明显退行性改变椎间盘，患者伤前无颈、肩痛病史,共30例,男29例,女1例,年龄16～38岁。所取标本均为髓核组织,生理盐水冲洗血迹,送往病理科石蜡包埋。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原位DNA片断末端标记

　　参照Gavrieli[5]的方法进行终末核苷酸转移酶( TdT)介导的dUTP原位末端标记(terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测细胞凋亡,细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。每例在400倍镜下,随机观察计数10个视野,记录阳性细胞数,以平均100个细胞中含凋亡细胞个数为凋亡指数(apopotic index,AI)。

　　1.2.2 SP免疫组织化学染色

　　一抗为兔抗人DR5多克隆抗体,为北京博奥森公司产品。所有标本均在同一条件下按照美国ZYMED公司即用型超敏SP-0023免疫组织化学试剂盒说明操作，一抗稀释度为1∶100,各步骤间均用PBS洗片。阳性对照选用经病理诊断为肺癌病理石蜡切片,用PBS代替一抗为阴性对照。细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞,每例切片双盲法计数,在400倍镜下,随机观察计数10个视野,记录阳性细胞率,即10个视野内阳性细胞总数/10个视野内细胞总数×100%。

　　1.2.3 统计学方法

　　采用SPSS 12.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两样本均数的比较采用独立样本t检验，相关分析采用Pearson相关分析，P值<0.05 为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 TUNEL染色

　　对照组颈椎间盘髓核内细胞较多，可见散在分布的TUNEL 染色阳性细胞。实验组髓核内细胞稀疏，可见细胞胞核棕黄着色并伴染色质边集的TUNEL 染色阳性细胞。实验组髓核内凋亡细胞率高于对照组，两组间比较差异有统计学意义。 TUNEL、DR5阳性细胞率的比较

　　2.2 SP免疫组织化学染色

　　对照组髓核内细胞较多，可见散在分布于软骨陷窝内的胞浆棕黄着色细胞，着色浅，胞膜皱缩，DR5 阳性细胞所占比例小;实验组髓核内细胞较少，可见散在分布于软骨陷窝内的胞浆棕黄着色细胞，着色深，胞膜皱缩，DR5 阳性细胞所占比例较大。与对照组相比较，患者组颈椎间盘髓核内DR5染色阳性细胞率明显上升，两组间的差异有统计学意义。

　　2.3 DR5阳性细胞率与凋亡细胞率之间的相关关系

　　经Pearson 相关分析，两组髓核内DR5阳性细胞率与TUNEL凋亡细胞率之间均成正相关，相关系数r=0.755(P<0.01),相关有统计学意义。

　　3 讨论

　　在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子超家族成员发挥了重要的作用[6]，其主要成员FasL、TNF-α及TRAIL等均通过死亡诱导信号途径来促使细胞凋亡。TRAIL,即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL )又称为Apo2L( ligand),是Wiley 1995年发现的TNF超家族成员，能迅速诱导表达TRAIL 特异受体的细胞发生凋亡。TRAIL最初是根据与Fas/Apo1和TNF具有序列的同源性被鉴定和克隆出来的。随后又发现了TRAIL的4种新的膜结合受体:死亡受体( death receptor,DR)，包括TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5),均含有死亡结构域并能向细胞内传递死亡信号,当TRAIL与DR结合时可以诱导靶细胞凋亡;诱骗受体( decoy recptor)，包括TRAIL-R3(DcR1)和TRAIL-R4 (DcR2),当TRAIL与DcR结合时可以逃避TRAIL诱导的细胞凋亡。以及1种可溶性受体OPG。TRAIL-R2 亦称DR5,经TRAIL活化后,DR5 胞浆内的死亡结构域与Fas相关死亡域蛋白的死亡结构域相偶联后,形成死亡诱导信号复合体。随后,Fas 相关死亡域蛋白通过和caspase-8的相互作用,导致caspase-8形成寡聚体,并驱使其自身活化。活化的caspase-8进一步活化caspase-3 、caspase-7等,使细胞DNA 断裂,最终导致细胞发生凋亡[7-8]。Treneh[9]等研究表明,TRAIL与受体的结合力是受温度控制的,在4℃时,TRAIL与其所有受体结合力相似,而在37℃时,TRAIL与DR5的结合力最高。因此,在机体及细胞最适宜的生存温度37℃时,DR5相对于其他受体来讲,以最强的亲和力与TRAIL结合并在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用。

　　近年来,国内外关于TRAIL的研究十分活跃,几乎涉及到临床医学的各个学科。但多集中在肿瘤领域,而在椎间盘的研究中很少见报道。牛涛等[4] 对31个正常椎间盘组织石蜡标本切片,用免疫组化方法检测证实在髓核、纤维环及软骨终板中存在TRAIL的表达,其中髓核中TRAIL表达高于纤维环及软骨终板,纤维环中表达最低,差异有统计学意义(F=23.51,q=3.190～9.526,P<0.05)。说明TRAIL在正常椎间盘组织的不同部位存在着区域性分布,提示在正常椎间盘组织中可能存在着由TRAIL/TRAIL-R 诱导的凋亡途径。本试验中，实验组颈椎间盘髓核细胞中TUNEL、DR5阳性细胞率均高于对照组(P<0.01)，同时两组髓核内DR5阳性细胞率和凋亡细胞率之间成正相关(r=0.755，P<0.01)。说明高水平的DR5表达参与了退变颈椎间盘髓核细胞的凋亡，DR5在椎间盘细胞凋亡的发生、发展中可能起重要作用，提示颈椎间盘退变过程中DR5/TRAIL途径与其他两条途径一样也发挥着作用,引起椎间盘退变。

　　本研究通过观察颈椎间盘内髓核组织细胞凋亡率及死亡受体DR5的表达情况及其相互关系，提示高水平的DR5表达参与了退变颈椎间盘髓核细胞的凋亡，由DR5/TRAIL诱导的凋亡途径可能在颈椎病颈椎间盘退行性变发生和发展中发挥重要作用。

　　【参考文献】

　　[1]Heyde CE,Tschoeke SK,Hellmuth M,et al. Trauma induces apoptosis in human thoracolumbar intervertebral discs[J].BMC Clin Pathol,2006,6: 5.

　　[2]Park JB,Lee JK,Park SJ,et al. Mitchondrial involvement in fas-mediated apoptosis of human lumbar disc cells[J].J Bone Joint Surg(Am),2005,87( 6) : 1338-1342.

　　[3]Weiler C，Nerlich AG，Bachmeier BE，et al.Expression and distribution of tumor necrosis factor alpha in human lumbar intervertebral discs:a study in surgical specimen and autopsy controls[J].Spine, 2005,30(1):44-53.

　　[4]牛涛,陈伯华,胡有谷.TRAIL 在正常椎间盘细胞中的分布及表达[J].青岛大学医学院学报,2007,439(3):265-266.

　　[5]Gavrieli,Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation[J]. J Cell Biol,1992,119 (4) : 493-501.

　　[6]Boos N,Weissbach S,Rohrbach H,et al. Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs[J].Spine,2002,27(23):2631-2644.

　　[7]Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,et al . Identification and characterization of a new member of t he TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3 (6) :673-682.

　　[8]Thorburn A. Death receptor-induced cell killing[J].Cell Signal,2004,16 (2) :139-144.

　　[9]Truneh A,Sharma S,Silveman C,et al. Temperature-sensitive differential affinity of TRAIL for its receptors：DR5 is the highest affinity receptor[J]. J Biol Chem,2000,275 (30) : 23319-23325.