骨保护素/核激活因子受体配体/核激活因子受体（OPG/RANKL/RANK）系统与人工关节置换术后的假体周围骨溶解

　　作者：孔令擘,朱庆生　　作者单位：第四军医大学西京医院骨科， 陕西 西安 710033

　　【摘要】人工关节置换术的推广和发展使得多种关节终末期疾病所致的病变获得了良好的临床改善，但术后假体周围骨质溶解这一问题却影响了人工关节远期疗效. 长期的研究发现破骨细胞是骨溶解主要原因，而近年研究发现的OPG/RANKL/RANK系统是破骨细胞分化过程中的一个重要信号传导通路，且体内多种激素或因子通过影响骨髓微环境内的OPG/RANKL比率来调节骨代谢. 为了给人工关节置换术后骨溶解所致的并发症的防治开辟新的思维，我们综述了OPG/RANKL/RANK系统以及其调控破骨细胞生成、分化对假体周围骨溶解的作用机制.

　　【关键词】 骨保护素;核因子κB受体活化因子配体;核因子κB受体活化因子;骨溶解

　　0引言

　　随着人工关节置换术的不断普及，人工关节置换术是治疗包括髋、膝关节等严重的关节终末期疾病的重要手段，并取得了令人满意的临床疗效，且随着组织工程学、材料学的发展和假体工艺的不断提高，术后感染、假体折断等并发症已减少，是患者重返正常生活的主要手术方式. 然而目前在全世界每年超过一百万接受过人工关节置换术后的患者中，行翻修术者却达到了20%[1]. 其中原因包括：人工关节机械性不稳定、疼痛复发、人工关节失败等诸多因素，但人工假体周围骨溶解引起的假体无菌性松动仍然是影响人工关节远期疗效的主要原因. 目前多数学者认为假体周围破骨细胞性骨溶解是主要原因，而其中作为破骨细胞分化过程的重要信号传导通路的OPG/RANKL/RANK系统[2]的发现不仅从分子水平阐述了各种骨吸收刺激因子激活破骨细胞的机制，且近期还有研究表明体内多种激素或细胞因子通过影响骨髓微环境内的OPG/RANKL比率来调节骨代谢[3]. 因此深入研究OPG/RANKL/RANK系统调控破骨细胞分化、成熟及其对假体周围骨溶解的作用机制，可望对防治破骨细胞性人工关节置换术后假体周围骨溶解开辟新的思维.

　　1OPG/RANKL/RANK系统结构及表达特征

　　OPG/RANKL/RANK系统是近年来发现的在破骨细胞分化过程中的一个重要信号传导通路，包括：核激活因子受体配体 (1igand of receptor activator of NFκB, RANKL)，或称为破骨细胞分化因子 (osteoclast diferentiation factor, ODF);其受体是位于破骨细胞膜上的核激活因子受体 (receptor activator Of NFκB, RANK);及RANKL的假性受体骨保护素 (osteopmtegerin, OPG)[4-5].

　　1.1OPG(骨保护素)骨保护素 (Osteoprotegerin, OPG) 是1997年美国和日本两个实验室分别用不同的方法同时发现的. 1997年，美国Amgen公司研究小组的Simonet等[4]在进行大鼠小肠cDNA测序时偶然发现了一种新的细胞因子，后鉴别出这是一种能调节骨吸收的糖蛋白，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体超家族成员，并根据其具有抑制破骨细胞分化和增加骨密度的功能而命名为骨保护素(OPG).

　　OPG属于TNFa超家族成员，但没有跨膜和细胞浆内的基团，并以可溶性蛋白形式分泌. 氨基酸测序证实了OPG是一种含有401个氨基酸残基的肝素结合分泌型糖蛋白，含7个结构域(D1D7)，在合成过程中裂解了21个氨基酸前肽后，就形成了一个含有380个氨基酸的成熟蛋白质[5-6]. OPG蛋白有单体和二聚体两种形式，分子量分别是60 kd和土20 kd，单体存在于成骨细胞内，但主要以二聚体形式存在于细胞外基质中. 在体内，其单体和二聚体的两种形式在热酸性上没有明显的差异，OPG单体具有更长的半衰期，而二聚体给药时的分布快于单体，且二聚体具有更强的肝素结合和降低血钙的能力，所以和单体相比，二聚体有更为广泛的应用前景.

　　1.2RANKL(核因子кB受体活化因子配体)OPG被发现后，美、日的研究者就认识到OPG可能就是识别在成骨细胞上表达的破骨细胞分化因子的关键. 两个研究组应用OPG做探针筛选出OPG的结合蛋白，分别命名为OPGL(OPG ligand)和ODF(osteoclast diferentiation factor)[5-6];与先前Anderson从鼠腺瘤EL40.5细胞的cDNA库中克隆出来发现的核激活因子受体配体(Ligand of receptoractivator of NFκB, RANKL)和TRANCE(TNF related activation induced cytokine)为同一物质[7]. 2000年，美国骨矿研究学会(ASBMR)下属专业命名委员会统一命名为核因子κB受体活化因子配体常用缩写名称RANKL.

　　人类RANKL基因定位于13q14，含有317个氨基酸肽，与TNF相关的致凋亡配体和CD40的同源性为30%，与FASL的同源性为20%. 属Ⅱ型跨膜蛋白. RANKL有两种存在形式：一种是分子量为(40～45)×103的跨膜结合蛋白，另一种是分子量为31×103的游离型多肽，系从140或145位氨基酸残基上割裂下来的膜外区部分. 膜结合型RANKL为其存在的主要形式[5-6]，并通过疏水作用与细胞核因子кB受体活化因子(RANKL)和OPG连接. 2004年Suzuki等[8]在下游结构内的起始密码子内发现了另外两个亚型：hRANKL2和hRANKL3. 这两个亚型都缺乏N端细胞内域，而且hRANKL3还缺乏跨膜域结构，而对于C端细胞外域来说这三个亚型的表达是一致的.

　　1.3RANK(核因子кB受体活化因子)Nakagawa等[9]从小鼠巨噬细胞样破骨细胞的前体细胞中克隆了与调节树突状细胞功能相关的TNFα超家族破骨细胞分化因子受体，并证明其就是RANK.

　　人类核激活因子受体(receptor activator of NFκB, RANK)是属于TNFR超家族的I型跨膜蛋白. 其定位于染色体18q22.1，并含有：28个氨基酸构成的信号肽，21个氨基酸短跨膜区及2个N2糖基位点的胞外区，和616个氨基酸. 破骨细胞的前体细胞、成熟破骨细胞、软骨细胞及乳腺上皮细胞内均有RANK表达.

　　2关节置换术后骨溶解的主要发病机制

　　骨溶解是一种与假体周围磨损颗粒引起的与假体周围结缔组织界膜慢性炎症反应有关 的术后并发症. 骨溶解的生物学表现为假体周围骨吸收活动增强，成骨性活动降低，使得骨 吸收与骨形成之间的动态平衡破坏. 骨溶解在影像学上观察可表现为：假体周围骨透亮区呈 平行、局灶性或膨胀性骨丢失，骨透亮区内看不到骨小梁[10]. 它是由于假体周围结缔组织界膜内慢性炎症反应侵蚀的结果.

　　Gie等[11]研究表明多数骨溶解与假体产生的磨损颗粒，如聚乙烯颗粒、金属颗粒、骨水泥颗粒等有关. 骨溶解的发病机制十分的复杂，目前认为诱发骨溶解的原因有： ① 磨损颗粒刺激假体骨界面组织中的巨噬细胞，引起由一系列细胞因子如：肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(1L)、花生四烯酸代谢产物(PGE2)和溶骨性细胞因子等介导的，作用于假体骨界面破骨细胞，使其分化成熟并造成局限性骨溶解的生物学效应. ② 金属钴、铬等金属引起的迟发型超敏反应，其中以磨损颗粒造成的CD25阳性活化的T淋巴细胞为主[12-13]. Turner等[14]研究认为骨溶解还与假体骨界膜之间的局部微环境有关，他们认为在慢性炎症的刺激下破骨因子与成骨因子的比例失衡，最终导致假体周围的骨溶解性破坏的发生. 而其中由磨损颗粒引起的破骨细胞性骨溶解在关节置换术后的假体周围骨溶解中的作用被认为意义重大.

　　3OPG/RANKL/RANK系统对关节置换术后骨溶解的作用

　　一个普通的人工髋关节置换术后的患者平均每年要步行106次，而每次步行所产生的磨损颗粒要超过105个[15]. 这些磨损颗粒会作用于假膜巨噬细胞并导致至少20种不同的骨吸收刺激因子如：细胞因子、生长因子、白细胞介素的产生，从而激活了破骨细胞，导致术后人工关节周围骨溶解现象出现[11]. 随着人们对OPG/RANKL/RANK系统对破骨细胞分化调控机制上的认识，加之原位杂交显示RANKL/RANK mRNA也在这些假膜巨噬细胞上表达，说明：OPG/RANKL/RANK系统是关节置换术后的骨溶解中重要的信号通路. 其主要机制是： ① 成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后促进破骨细胞的分化，从而引起骨溶解. ② 成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK之间的结合，从而抑制骨溶解的产生[16].

　　3.1关节置换术后磨损颗粒与OPG/RANKL/RANK系统的表达Yasuda H等[5]研究表明OPG/RNAKL/RANK系统在骨代谢的过程中起着至关重要的轴枢作用，其中OPG可以抑制破骨细胞的分化与激活，并且可以增加磨损颗粒产生的破骨细胞的凋亡. Itonaga等[17]研究表明：假膜中的巨噬细胞中含有破骨细胞前体细胞，这些细胞在表达巨噬细胞表型特征的同时，还表达RANK. 假膜巨噬细胞在磨损颗粒作用下产生的各种骨吸收刺激因子可能是通过影响RANKL和OPG的产量，实现刺激破骨细胞的分化与活化. Coati等[18]对假膜中相关基因的表达情况进行原位研究，发现RANKL, RANK以及OPG的 mRNA表达可在假膜中被发现，证明了OPG/RANKL/RANK系统参与假体周围骨溶解中破骨细胞分化与表达的调控. Nagai等[19]通过实验认为不同磨损颗粒诱导破骨细胞形成的效能各异，可能主要由于诱导产生RANKL和RANK水平不同. 最近Blair等[20]又通过转基因小鼠对 OPG/RANKL/RANK系统在骨溶解中的主要作用进行了阐明：RANKL-/-和RANK-/-小鼠由于缺乏破骨细胞而患有骨硬化症，而OPG-/-小鼠表现为严重的骨质疏松症且可以观察到较多的破骨细胞含量.

　　3.2OPG/RANKL/RANK系统的失衡状态与骨溶解OPG/RANKL/RANK系统的发现使我们对成骨细胞调控破骨细胞分化与活化的分子机制有所认识. 而研究表明RNAKL和OPG的平衡状态对于破骨细胞的调控是至关重要的[5]. 关节置换术后的发生骨溶解的人工关节周围组织内的OPG/RANKL/RANK系统表达呈失衡状态，在发生骨溶解的人工关节的周围界膜内可以检测到较高的RANKL、RANK的mRNA的表达，而OPG的含量却和正常及骨关节炎滑膜内的含量无显著差异,即RNAKL/OPG的比值增加. 因此，RANK和OPG的相对生物利用度被认为是在同样病理情况下决定骨溶解的程度的主要原因.

　　Nathalie等[21]报道了在体内,多量的OPG可以抑制多核的破骨样细胞的形成，并减少破骨细胞标记物的表达. Feng等[22]研究发现RANKL和OPG对于破骨细胞的形成和其功能的调控与成骨细胞不同. ① 过量的RANKL与破骨细胞前体上的RANK结合，并对破骨细胞的活性进行调节，② 而过量的OPG与RANKL结合，能够阻止RANKL与RNAK的相互反应，并减少破骨细胞的形成. Kim等[23]在对全髋关节置换手术因假体周围骨溶解导致的假体松动而失败病例的髋关节的关节液进行检测后发现：失败组关节液中OPG含量明显低于正常关节组，分析认为这一现象可能与破骨细胞大量分化与活化过程中的OPG消耗过多有关. Masui等[24]通过实验发现在人工关节置换术后假体产生的磨损颗粒中Ti6A14V与高分子聚乙烯等颗粒能引起RANKL/OPG的比值增加，从而引发骨溶解的发生. Mandelin等[25]发现: ① 在发生了骨溶解的假体周围的间质内RANK和RANKL的mRNA含量是明显增多的. ② OPG集中在其他细胞组织(血管内皮细胞)中，表明OPG没有干预RANKL+和RANK+直接接触. 研究说明可溶的OPG无法阻止RANKL与RANK之间的相互反应. 这些实验结果还与其他破骨细胞的细胞因子能够通过细胞联合与RANKL被调节的假说相符[26]. 这说明置换术后的假体周围骨溶解与RANKL/OPG比例失衡有密切相关性.

　　3.3其他因素对OPG/RANKL/RANK系统的调节作用近来学者们通过研究发现，有20多种基因如：cfms，cfos，csrc，TRAP，CATK等在破骨细胞的分化成熟过程中起着关键的调节作用，其中有多种基因对 OPG/RANKL/RANK系统起着调节作用[3]. 如cfms基因，是MCSF受体的编码基因，它直接关系着GMCSF(粒巨噬细胞集落刺激因子)受体的活性，MCSF和cfms编码后的受体结合可以激活一个信号传导通路，这条通路提高破骨细胞前体的活性，并且可以增量调节RANK的表达[27]. Granchi等[28]通过实验发现cfos和csrc基因对基于RANKL/RANK信号通路后发生的破骨细胞的分化成熟起着很重要的作用. 近来Feng等[22]发现肿瘤坏死子受体联合因子(TRAFs)可以进入到RANK的细胞内，其中TRAFsl3，5和6都参与了破骨细胞前体细胞和RANKL/RANK信号通路的活化过程，如通过JNK,Erk等激活RANK，这些通路调节了破骨细胞的前体的融合、分化并对成熟后的破骨细胞的活性经行调节. Itonaga等[17]还发现假膜中T细胞也有可能通过改变RANKL和OPG的产量影响破骨细胞的分化与活化. Sabokbar等[29]发现假体周围界膜组织中的成纤维细胞能通过TNFa和RANKL等的作用，促进血液内的单核细胞向破骨细胞分化. Komine等[30]研究表明，在骨溶解中OPG系统和 TNFα, IL1β具有协同作用.

　　总之，在人工关节置换术后假体周围骨溶解的生物学发病机制中，假体周围界膜中的巨噬细胞在人工关节磨损微粒作用下，假膜细胞以及假膜周围细胞产生的许多骨吸收刺激因子是以OPG/RANKL/RANK系统作为其的直接靶目标，并且在多种因素介导下最终通过影响OPG/RANKL/RANK系统,使其中RANKL和OPG失衡表达，来实现刺激破骨细胞的分化与表达，最终导致假体周围骨溶解的.

　　4前景与展望

　　OPG/RANKL/RANK系统是人们对于骨生物领域持续探索了数十年过程中的重大发现，它对于深入认识包括人工关节置换术后假体周围骨溶解在内的多种骨破坏性疾病的发病机制以及指导临床药物治疗具有重要指导意义. 然而OPG/RANKL/RANK系统调节破骨细胞的分化和功能虽已为人们熟知，但其独特地诱导破骨细胞终末分化的机制及其与其他信号转导途径间的关系还未完全弄清. 尽管临床上使用OPG在治疗人工关节置换术后骨溶解或是其他骨代谢的疾病上有美好的前景，但在实际应用中还存在许多问题，如：如何获得有生理活性的OPG蛋白，如何在抑制骨吸收的同时促进骨形成等. 对此，目前许多研究都针对抑制RANKL的信号通路展开，其中包括使用OPG、可溶性RANK、或是中和性的单克隆RANKL抗体，这些近期的新产品对于抑制骨溶解或其他骨吸收性疾病都有不错的效果. 而且，重组OPG在体内的研究也取得初步进展，如：对绝经妇女使用重组OPG的体内研究显示：重组OPG的体内安全性也较令人满意[31]. 因此对于OPG/RANKL/RANK更加深入和系统的研究，将对于包括关节置换术后骨溶解在内的多种骨代谢疾病的发病机制的全面理解及临床预防和治疗具有十分重要的意义.

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