退变颈椎间盘组织中细胞凋亡及TRAIL表达的研究

　　作者：锁志刚1,王庆锋1,丁惠强2　　作者单位：1.宁夏医科大学,银川750004;2.宁夏医科大学附属医院骨科,银川750004

　　【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrotic factor-related apoptosis-inducing ligand ,TRAIL)在颈椎间盘退变中的作用。方法采用原位DNA片段末端标记( TUNEL)法和免疫组织化学方法，对比观察30例颈椎病退变颈椎间盘组织细胞及30例创伤对照颈椎间盘组织细胞凋亡状态及TRAIL的表达。结果 TUNEL染色观察示颈椎病组的髓核内的平均凋亡细胞率为(10.93±1.87)%，高于对照组的(6.43±1.56)%(P<0.01)。 SP 免疫组织化学染色示颈椎病组髓核内TRAIL染色阳性细胞率为(49.13±15.66)%，高于对照组的(20.26±2.81)%，差异有统计学意义 (P<0.01)。将对照组和颈椎病组全部60例颈椎间盘标本合并后进行Pearson相关分析,颈椎间盘髓核内TRAIL染色阳性细胞率与 TUNEL阳性细胞率之间呈正相关，相关系数r=0.921(P<0.01)。结论 颈椎病椎间盘组织细胞凋亡数与TRAIL阳性细胞数均明显高于创伤对照组，且凋亡与TRAIL的表达呈正相关。

　　【关键词】 颈椎间盘;退行性变;细胞凋亡;TRAIL

　　现阶段，临床治疗颈椎病的方法包括药物、颈椎牵引制动和手术切除病变颈椎间盘或颈椎管成形，这些方法均是为了解除突出颈椎间盘对颈部脊髓、神经或血管的压迫，并非针对颈椎间盘退变本身，而且经手术切除病变椎间盘并融合相应脊柱节段后往往造成相邻椎间盘的加速退变甚至突出[1]。因此，为阻止颈椎病的发生发展，有必要从颈椎间盘退变这一环节实施干预。大量的研究显示,椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关，退变椎间盘中椎间盘细胞凋亡机制仍然未阐明。本研究对30例颈椎病退变颈椎间盘组织及30例创伤对照颈椎间盘组织细胞凋亡状态及髓核组织中TRAIL的表达进行观察，探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrotic factor-related apoptosis-inducing ligand ,TRAIL) 凋亡途径在颈椎间盘退变中的作用。

　　1材料与方法

　　1.1取材及分组颈椎间盘组织(C3 - C7)取自2007年5月-2009年1月本院骨科。标本分为2组:颈椎病组为经手术治疗的脊髓型颈椎病患者,标本来源于脊髓型颈椎病患者经前路手术所取得的椎间盘组织共30例, 男24例,女6例,年龄46～74岁。均经术后病理检查证实为退变椎间盘组织。对照组为经手术治疗的颈椎创伤患者,伤前无颈、肩痛病史,标本来源于颈椎创伤患者前路手术所取得的椎间盘组织共30例,男29例,女1例,年龄16～38岁,术后病理检查证实为无明显退行性改变椎间盘组织。所取标本均为髓核组织,生理盐水冲洗血迹,送往病理科石蜡包埋。

　　1.2方法

　　1.2.1原位DNA片断末端标记参照Gavrieli[2]的方法进行终末核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP原位末端标记 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL )法检测细胞凋亡,细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。每例在400倍镜下,随机观察计数10个视野,记录阳性细胞数,以平均100个细胞中含凋亡细胞个数为凋亡指数(apopotic index,AI)。

　　1.2.2SP免疫组织化学染色一抗为兔抗人TRAIL多克隆抗体,为北京博奥森公司产品。所有标本均在同一条件下按照美国ZYMED公司即用型超敏SP-0023免疫组织化学试剂盒说明操作，一抗稀释度为1∶100,各步骤间均用PBS洗片。阳性对照选用经病理诊断为宫颈癌的病理石蜡切片,用 PBS代替一抗为阴性对照。细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞,每例切片双盲法计数,在400倍镜下,随机观察计数10个视野,记录阳性细胞率,即10 个视野内阳性细胞总数/10个视野内细胞总数×100%。

　　1.3统计学方法采用SPSS 12.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两样本均数的比较采用独立样本t检验，相关分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1TUNEL 染色

　　对照组颈椎间盘髓核内细胞较多，可见散在分布的TUNEL染色阳性细胞。颈椎病组髓核内细胞稀疏，可见细胞胞核棕黄着色并伴染色质边集的 TUNEL染色阳性细胞。颈椎病组髓核内凋亡细胞率明显高于对照组，两组间比较差异有统计学意义。对照组和患者组颈椎间盘髓核内 TUNEL、TRAIL阳性细胞率的比较

　　2.2SP免疫组织化学染色

　　对照组髓核内细胞较多，可见散在分布于软骨陷窝内的胞浆棕黄着色细胞，着色浅，胞膜皱缩，TRAIL 阳性细胞所占比例小;颈椎病组髓核内细胞较少，可见散在分布于软骨陷窝内的胞浆棕黄着色细胞，着色深，胞膜皱缩，TRAIL阳性细胞所占比例较大。与对照组相比较，颈椎病组颈椎间盘髓核内TRAIL染色阳性细胞率明显上升，两组间的差异有统计学意义。

　　2.3TRAIL阳性细胞率与凋亡细胞率之间的相关关系经Pearson 相关分析，两组髓核内TRAIL阳性细胞率与TUNEL凋亡细胞率之间均成正相关，相关系数r=0.921(P<0.01),相关有统计学意义。TRAIL阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率间的相关性(r=0.969，P<0.01)

　　3讨论

　　国内外学者对椎间盘退变的机制进行了较多研究，发现退变椎间盘内的变化包括存活细胞数量减少、蛋白多糖及水含量降低、胶原纤维的含量和类型改变、炎症介质释放和基质金属蛋白酶激活等，其原因包括年龄因素、过度载荷、外伤、吸烟、血管硬化、糖尿病、遗传因素等。另外，研究发现椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡引起的细胞基质代谢障碍有关，细胞凋亡的增加是椎间盘退变发生和发展的重要因素。在运动系统，椎间盘的结构和功能相当于四肢的关节，Blanco 等[6]的研究表明，在骨性关节炎(ostoearthritis，OA)的发生发展过程中，关节软骨内软骨细胞的凋亡起了关键作用。Gruber 等[7] 首先发现椎间盘内有相当高的细胞凋亡率，对手术取出的退变腰椎间盘进行细胞凋亡检测发现，椎间盘细胞的凋亡率高达53%～73%，认为该结果是由于对照组的年龄(57.2±3.1)岁显著高于手术组的(44.3±3.2)岁造成的。Roberts 等[8] 对Gruber 的HE 实验结果提出了质疑，认为如此高的细胞凋亡率将导致椎间盘细胞于短期内丧失殆尽。本研究发现，TUNEL染色观察示颈椎病组平均凋亡阳性细胞率为 (10.93±1.87)%，高于对照组的(6.43±1.56)%(P<0.01)，这与大多数学者的结果一致，表明细胞凋亡在椎间盘髓核细胞退变发生发展中起重要作用。

　　在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子超家族成员发挥了重要的作用，到目前为止,已发现3种诱发细胞凋亡的死亡因子：FasL、TNF- α及TRAIL,它们通过死亡受体诱导信号途径来促使细胞凋亡。TRAIL又称为Apo2L( ligand) ,是Wiley1995年发现的TNF超家族成员，能迅速诱导表达TRAIL 特异受体的细胞发生凋亡。近年来,国内外关于TRAIL的研究十分活跃,多集中在肿瘤领域,而在椎间盘的研究中很少见报道。Zhang L等[9] 研究发现，突出的腰椎间盘髓核组织中细胞凋亡率明显高于正常椎间盘，细胞凋亡与椎间盘退变严重的程度呈正相关，在突出椎间盘组织中DR4的表达均呈强阳性，而正常间盘组织中DR4偶见弱阳性表达，提示 TRAIL/DR4通路在椎间盘细胞凋亡中可能起着重要作用。牛涛等[10] 对31个正常椎间盘组织标本用免疫组化方法检测TRAIL的表达,在髓核、纤维环及软骨终板中存在TRAIL的表达,其中髓核中TRAIL表达最高，说明 TRAIL在正常椎间盘组织的不同部位存在着区域性分布, 提示在正常椎间盘组织中可能存在着由TRAIL/TRAILR 诱导的凋亡途径。在我们的试验中，颈椎病组颈椎间盘髓核细胞中TRAIL阳性细胞率高于对照组阳性细胞率，同时两组髓核内TRAIL阳性细胞率和凋亡细胞率之间成正相关,说明高水平的TRAIL参与了退变颈椎间盘细胞的凋亡，TRAIL/TRAILR诱导的凋亡途径在椎间盘细胞凋亡的发生、发展中可能起重要作用。

　　本研究通过观察颈椎间盘内髓核组织细胞凋亡率及TRAIL表达情况及其相互关系，说明颈椎病椎间盘组织细胞凋亡数与TRAIL阳性细胞数均明显高于创伤对照组，且凋亡与TRAIL的表达呈正相关。提示高水平的TRAIL表达可能参与了退变颈椎间盘细胞的凋亡，TRAIL/TRAILR诱导的凋亡途径在椎间盘细胞凋亡的发生、发展中可能起重要作用，为更深入了解颈椎间盘退变的细胞凋亡机制以及将来通过生物学方法防治颈椎间盘退变提供了初步的实验依据。

　　【参考文献】

　　[1]Ishihara H，Kanamori M，Kawaguchi Y，et al.Adjacent segment disease after anterior cervical interbody fusion[J].Spine，2004，4(6):624-628.

　　[2]Gavrieli, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation[J]. J Cell Biol, 1992, 119(4):493-501.

　　[3]Smale G,Nichols NR,Brady DR,et a1.Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer's disease[J].Exp Neuro1,1995,133(2):225-230.

　　[4]陈凤华，陈翠真，宋旭东.老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡的DNA片断分析及TUNEL检测[J].眼科研究，1999，17(6):454-456.

　　[5]Usami S,Takumi Y,Fujita S,et al.Cell death in the inner ear associated with aging is apoptosis? [J]. Brain Res，1997，747(1):147-150.

　　[6]Blanco FJ,Guitian R,Vazquez-Martul E,et al.Osteoarthritis chondrocytes die by apoptosis.A possible pathway for osteoarthritis pathology[J]. Arthritis Rheum，1998，41(2):284-289.

　　[7]Gruber HE Hanley，EN Jr.Analysis of aging and degeneration of the human intervertebal disc comparision of surgical specimens with normal controls[J]. Spine，1998，23 (7)：751-757

　　[8]Roberts S, Johnson WE. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc[J]. Spine, 1999, 24(5): 500.

　　[9]Zhang L, Niu T, Yang SY, et al.The occurrence and regional distribution of DR4 on herniated disc cells: a potential apoptosis pathway in lumbar intervertebral disc[J]. Spine， 2008， 33(4):422-427.

　　[10]牛涛, 陈伯华, 胡有谷.TRAIL 在正常椎间盘细胞中的分布及表达[J].青岛大学医学院学报, 2007, 439(3): 265-266.