bFGF对rhBMP2诱导犬气管损伤后软骨再生的作用

　　作者：李小飞,闫小龙,韩静,汪健,卢强　　作者单位：第四军医大学唐都医院胸外科，陕西 西安 710038，第四军医大学西京医院眼科，陕西 西安 710033

　【摘要】 目的： 研究应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)诱导犬气管环部分缺损后软骨再生的可行性. 方法: 切除连续5个气管环前端的部分软骨，形成1 cm×3 cm的气管原位软骨缺损，建立犬气管软骨缺损模型. 将18只犬随机分为A，B，C组，每组6只，A组为对照组，于软骨缺损处未行任何处理，B组于气管软骨缺损部位植入rhBMP2/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)复合材料，C组于气管软骨缺损部位植入rhBMP2/bFGF/PVP复合材料. 于术后12wk处死各实验犬，行大体及组织学检查，组织学半定量测定新生软骨情况. 结果: A组气管软骨损伤残端出现气管软骨软化现象，气管管腔狭窄明显，软骨缺损处未见新生软骨生成;B，C两组气管软骨损伤部位残端未见气管软化，管腔狭窄不明显，软骨缺损处可见新生软骨及软骨岛生成，其中C组诱导新生软骨面积较B组更大(P<0.05). 结论: rhBMP2/PVP及rhBMP2/bFGF/PVP缓释系统均可诱导气管软骨再生，rhBMP2/bFGF/PVP缓释系统效果优于rhBMP2/PVP缓释系统. bFGF可能具有促进rhBMP2诱导犬气管损伤后软骨再生的作用.

　　【关键词】 骨形态发生蛋白;碱性成纤维细胞生长因子;聚乙烯吡咯烷酮;气管;软骨;再生

　　Enhancing effects of bFGF on regeneration of tracheal cartilage in a canine trachea injury model induced by rhBMP2

　　LI XiaoFei, YAN XiaoLong, HAN Jing, WANG Jian, LU Qiang, XU Hong, CHENG QingShu

　　Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM： To investigate whether basic fibroblast growth factor (bFGF) enhances regeneration of tracheal cartilage in trachea injured canine induced by the recombinant human bone morphogenetic protein2 (rhBMP2). METHODS: A 1 cm×3 cm gap was made in the anterior cervical trachea by removing 3 cm long strips of 5 sequential cartilages. In the control group (n=6), the gaps were left untreated. In the rhBMP2/PVP group (n=6), slow release system rhBMP2/PVP was implanted in each defect. In the rhBMP2/bFGF/PVP group (n=6), slow release system rhBMP2/bFGF/PVP was implanted in each defect. The tracheas were harvested at 12 weeks postoperatively. The cervical tracheas were then removed and evaluated grossly and histopathologically. The areas of regenerated cartilage were calculated. RESULTS: Tracheomalacia and the stenosis of the tracheal lumen were observed in the control groups but no regenerated cartilage was detected in the control groups at 12 weeks after surgery. In contrast, no tracheomalacia and no obvious stenosis of the tracheal was observed in the rhBMP2/PVP group and rhBMP2/bFGF/PVP groups. Regenerated cartilage was also observed in both groups at 12 weeks after surgery. This regenerated cartilage maintained the integrity of the internal lumen for longer than 3 months. The areas of regenerated cartilage in rhBMP2/bFGF/PVP group were larger than those in rhBMP2/PVP group (P<0.05). CONCLUSION: Both slow release systems, rhBMP2/PVP and rhBMP2/bFGF/PVP, can induce regeneration of tracheal cartilage in a canine model. rhBMP2/bFGF/PVP has stronger effect in inducing the regeneration of tracheal cartilage, indicating that bFGF may enhance rhBMP2 to induce regeneration of rhBMP2 induced injured tracheal cartilage.

　　【Keywords】bone morphogenetic protein; basic fibroblast growth factor; polyvinylpyrrolidone; trachea; cartilage; regeneration

　　0 引言

　　骨形态发生蛋白(BMP)能够在宿主体内诱导未分化的、有活力的间充质干细胞 (MSCs)定向分化为骨或软骨细胞[1]，已证实重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)可诱导气管移植体软骨再生[2]. 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)是一种多功能生物活性物质，作为毛细血管增殖刺激剂，能明显增强BMP在体内的成骨诱导作用[3]. 我们将BMP与bFGF复合聚乙烯吡咯烷酮(PVP)缓释材料用于气管软骨缺损修复，为气管软骨缺损修复寻求一种理想的材料.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 rhBMP2(第四军医大学西京医院全军骨科研究所)，小鼠肌袋生物学活性试验证实rhBMP2诱导成骨活性良好;bFGF(珠海东大生物制药有限公司);PVP (第四军医大学西京医院全军骨科研究所，直径1 mm，椭圆形，色白), 医用生物蛋白胶(广州倍绣生物技术有限公司). 健康成年雄性杂种犬18只, 体质量15～20 kg(西安地区). HPIAS1000 彩色病理图像分析仪(同济医科大学千屏影像公司).

　　1.2 方法

　　1.2.1 rhBMP2/PVP复合物的制备[4] 将rhBMP2加0.1 mol/L PBS溶液(pH=7.4)后，用物理方法匀浆成混悬液，PVP加0.1 mol/LPBS溶液溶解后即为有粘性的溶液，将PVP溶液与rhBMP2混悬液充分混匀，PVP与rhBMP2的复合量为10 mg PVP∶5 μg rhBMP2，90 mmHg下负压抽吸，放入冻干机逐步冻干，分装，每份含rhBMP2 5 μg，环氧乙烷消毒后备用.

　　1.2.2 rhBMP2/bFGF/PVP复合物的制备[4] 将rhBMP2加0.1 mol/L PBS溶液(pH=7.4)后，用物理方法匀浆成混悬液，rhBMP2和PVP加0.1 mol/L PBS溶液溶解后即为有粘性的溶液，PVP与rhBMP2的复合量为10 mg PVP∶40活性单位(IU)bFGF. 将bFGF/PVP溶液与rhBMP2混悬液充分混匀，PVP与rhBMP2的复合量为10mg PVP∶5 μg rhBMP2，真空抽吸，放入冻干机逐步冻干，分装，每份含rhBMP2 5 μg，bFGF 40 IU，环氧乙烷消毒后备用.

　　1.2.3 手术 ①动物分组 将犬随机分为A，B，C 3组，每组6只，A组为对照组，于软骨缺损处未行任何处理;B组于气管软骨损伤部位植入BMP/PVP复合材料，C组于气管软骨损伤部位植入rhBMP2/bFGF/PVP. ②麻醉及手术操作方法 将速眠新按0.15 mg/kg 肌肉注射全身麻醉. 仰卧位固定于手术台上, 经口气管插管，自主呼吸. 颈部正中纵形切口，长约10 cm. 分离皮下及肌肉组织显露颈段气管，切开气管前筋膜. 切除连续5个气管环前端中线附近部分软骨，形成1 cm×3 cm的气管原位软骨缺损，保留缺损局部的气管黏膜. B组于气管软骨缺损部位植入rhBMP2/PVP复合材料，每环缺损植入rhBMP2/PVP 1 mg;C组于气管软骨缺损部位植入rhBMP2/bFGF/PVP复合材料，每环缺损植入rhBMP2/bFGF/PVP 1 mg(图1). 医用生物蛋白胶封闭缺损部位，以防止局部渗血稀释复合物，逐层缝合颈部切口. ③术后处理及取材时间 所有动物均于术后立即给予青霉素肌注80万u，术后第1日起肌肉注射青霉素80万u，2次/d，共7d，并接受相同喂养. 均于术后12 wk处死.

　　损伤模型及复合材料植入方法

　　1.2.4 观察指标 ①动物存活情况 各组动物术后生存状况，如有无切口感染、呼吸困难等现象. ②大体改变 达到预杀期后将实验犬处死并立即取材，40 g/L甲醛溶液中固定，观察气管的通畅程度. ③组织学观察 各组标本进行软骨脱钙、脱水、固定、石蜡包埋及切片， HE染色，光镜下观察. ④定量组织学测定新生软骨面积 冠状面连续切取软骨缺损区新生组织, 获得4 μm厚的组织学切片，每隔100 μm切取1张. 应用HPIAS1000 彩色病理图像分析仪测定每只实验犬软骨缺损区总的新生软骨面积，于各标本每个环间缺损植入复合物区，随机选取10个×200视野作为测定区.

　　统计学处理：将各组织切片在统一的倍数下观察, 计算各组织切片新生软骨细胞、软骨基质及软骨岛的像素面积. 用KruskalWallis H非参数检验(方差不齐)及多个独立样本两两比较的Nemenyi法检验，P<0.05为有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 动物的生存状况和存活率 各组实验犬术后存活均达到预杀期(12 wk)，均未发生切口感染等并发症. A组实验犬在达到预杀期前略有呼吸困难，实验犬吠时可闻及喘鸣，B，C组实验犬在达到预杀期前无呼吸困难，未闻及喘鸣.

　　2.2 大体改变 A组标本气管环损伤处管壁有塌陷, 管腔明显狭窄，狭窄程度均超过50%;B，C组犬气损伤处管腔通畅，气管狭窄未超过20%;各软骨缺损损伤处肉眼下均未见到新生软骨管环组织.

　　2.3 组织学表现 A组缺损区可见纤维结缔组织填充，少量新生毛细血管生成，缺损区临近的气管环软骨组织部分软化吸收. B，C两组缺损区纤维结缔组织内可见大量间充质细胞聚集，单位视野下新生毛细血管比A组多，植入区多见不成熟的新生软骨细胞聚集，有不均匀软骨基质形成，新生软骨主要为纤维软骨，也可见类似于气管软骨的新生透明软骨，其中C组软骨细胞形成多个软骨岛，两组缺损区临近的软骨组织无软化吸收，并可见缺损区临近的软骨膜下新生软骨.

　　A： 对照组; B： rhBMP2/PVP组; C： rhBMP2/bFGF/PVP组. rhBMP2：重组人骨形态发生蛋白2;PVP：聚乙烯吡咯烷酮;bFGF：碱性成纤维细胞生长因子.

　　各组软骨缺损区术后新生软骨情况 HE ×200

　　2.4 定量组织学结果 A，B，C 3组的新生软骨像素面积分别为102±33，8219±1892，19 666±25 316.3组间整体比较差别有显著性(χ2= 24.010, df=3, P<0.01);两两比较:A与B，A与C，B与C有显著性(χAB2=29.312, P<0.01, χAC2=34.095, P<0.01，χBC2=8.365, P<0.01).

　　3 讨论

　　临床常见气管外伤所导致的气管软化，但目前还没有标准的治疗方法[5-6]. 我们的前期实验[2，7-8]已证实rhBMP2可诱导自体及异体的犬气管移植体软骨再生，所诱导生成的新生软骨有助于防止气管移植体的管腔软化塌陷，配合有效的措施促进再血管化，可以增强rhBMP2诱导犬气管移植体软骨的再生[9]. bFGF是一种强大的毛细血管增殖刺激剂，能明显促进血管内皮细胞的有丝分裂及血管早期形成. bFGF具有刺激成软骨细胞和软骨细胞的增殖作用，促进毛细血管向移植物中长入，使骨再生早期的组织中软骨岛数量增多[10]. 因此，bFGF将可能成为解决长段气管移植物再血管化的重要辅助手段. BMP和bFGF共同参与了骨和软骨生长代谢的调节，BMP启动骨形成过程后，为bFGF提供了大量靶细胞，从而使BMP和bFGF在生物学功能上形成互补，进而加速骨诱导、骨形成过程. PVP作为载体，能稳定生物大分子并防止其变性[11]. 而PVP天然的交链网状结构也有助于BMP和bFGF的附着及它们与靶细胞接触，其强大的粘着力利于BMP和bFGF的缓慢释放.

　　我们的结果显示，未植入任何材料的对照组缺损区可见纤维结缔组织填充，未见明显的新生软骨，缺损区临近的气管环软骨组织可见部分软化吸收. 而植入rhBMP2/PVP及rhBMP2/bFGF/PVP复合材料的两组缺损区纤维结缔组织内可见大量间充质细胞聚集，植入区多见不成熟的新生软骨细胞聚集，有不均匀软骨基质形成，其中rhBMP2/bFGF/PVP组软骨细胞已形成多个软骨岛，两组缺损区临近的软骨组织无软化吸收，并可见缺损区临近的软骨膜下新生软骨. 应用rhBMP2/bFGF/PVP组修复的标本新生软骨像素面积较rhBMP2/PVP组高. 大体观察发现A组气管环损伤处管壁有塌陷, 管腔狭窄程度均超过50%，B，C组气损伤处管腔通畅，气管狭窄均未超过20%. 我们的结果提示：rhBMP2能在气管软骨缺损处诱导新生软骨，并诱导损伤的气管软骨残端软骨膜下成软骨;bFGF能增强rhBMP2的这一作用，所诱导的新生软骨有助于维持气管损伤部位的管腔形态.

　　【参考文献】

　　[1] Urist MR, Lietze A, Mizutani H, et al. A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein (BMP) fraction[J].　Clin Orthop Relat Res, 1982, 16(2):219-232.

　　[2] 李小飞，程庆书，王道喜，等. 自体气管移植软骨再生的研究[J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(9):833-834.

　　[3] Akita S, Fukui M, Nakagawa H, et al. Cranial bone defect healing is accelerated by mesenchymal stem cells induced by coadministration of bone morphogenetic protein2 and basic fibroblast growth factor[J]. Wound Repair Regen, 2004, 12(2):252-259.

　　[4] 李亚非， 胡蕴玉， 李 青. 经皮注射骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子促进兔骨缺损愈合[J]. 中华骨科杂志, 1995, 15(9):624- 626.

　　[5] Tcacencu I, Carlsoo B, Stierna P. Effect of recombinant human BMP2 on the repair of cricoid cartilage defects in young and adult rabbits: a comparative study[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2005, 69(9):1239-1246.

　　[6] Hanawa T, Ikeda S, Funatsu T, et al. Development of a new surgical procedure for repairing tracheobronchomalacia[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1990, 100(4):587-594.

　　[7] 李小飞，程庆书，王道喜，等. 骨形态发生蛋白诱导犬的自体及异体气管移植体软骨再生的比较[J].第四军医大学学报, 2003, 24(3):203-205.

　　[8] 闫小龙， 李小飞， 刘 勇， 等. 深低温冷冻对rhBMP2诱导犬气管移植体软骨再生的影响[J]. 第四军医大学学报, 2005, 26(2):160-163.

　　[9] 李小飞， 卢 强， 程庆书， 等. 骨形态发生蛋白复合肌瓣的自体气管的移植[J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22(3):373.

　　[10] Niswander L, Martin GR. FGF4 and BMP2 have opposite effects on limb growth[J]. Nature, 1993, 361(6407):68-71.

　　[11] Park IK, Ihm JE, Park YH, et al. Galactosylated chitosan (GC)graftpoly(vinyl pyrrolidone) (PVP) as hepatocytetargeting DNA carrier. Preparation and physicochemical characterization of GCgraftPVP/DNA complex[J]. J Control Release, 2003, 86(2-3):349-359.