PPARγ激活对糖基化终末产物引起的大鼠肾系膜细胞TGFβ及CTGF mRNA表达的影响

　　作者：刘辉,于晓艳,魏海峰,石,艳,苗春生,李　　作者单位：吉林大学药学院实验药理与毒理教研室，吉林 长春

　　【摘要】目的 观察过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)激活对糖基化终末产物(AGEs)引起的大鼠肾系膜细胞TGFβ及CTGF mRNA表达的影响。方法 体外培养正常大鼠肾系膜细胞，逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测不同浓度AGEs(0～400 μg/ml1)及不同浓度PPAPγ)激活剂(罗格列酮)和PPARγ阻断剂(GW9662)对AGEs(100 μg/ml-1)引起的TGFβ及CTGF mRNA表达的影响。结果 给予PPARγ激活剂可明显减轻AGEs引起的大鼠系膜细胞TGFβ、CTGF mRNA的表达。结论 PPARγ激活剂可以明显减轻AGEs对系膜细胞TGFβ、CTGF mRNA的表达影响，从而改善肾小球细胞外基质积聚,在糖尿病时起到肾脏保护作用。

　　【关键词】 过氧化物酶体增殖体激活受体γ;糖尿病肾病; 糖基化终末产物;转化生长因子β;结缔组织生长因子

　　【Abstract】 Objective To investigate the role of peroxisome proliferatoractivated receptor(PPAR)γ activation on the expressions of TGFβ and CTGF mRNA in rat mesangial cells extenuation induced by advanced glycation end products (AGEs). Methods Rat mesangial cells were treated with AGEmodified bovine serum albumin or native bovine serum albumin. Normal mesangial cells without any treatments were as control. TGFβ and CTGF mRNA were analyzed by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). The expressions of TGFβ and CTGF mRNA in mesangial cell induced by rosiglitazone (0～10 μmol/L) and the inhibitor of PPARγ(10 μmol/L) were tested with RTPCR. Results PPARγ activation relieved TGFβ and CTGF mRNA expressing induced by AGEs(0～400 mg/L) in mesangial cells. Conclusions PPARγ activation can relieve the expressions of TGFβ and CTGF mRNA in rat mesangial cells induced by AGEs，suggesting that PPARγ activation has a kidney protection in diabetic mellitus through ameliorating extracellular matrix accumulation.

　　【Key words】 Peroxisome proliferator activated receptorγ; Diabetic nephropathies; Glycosylation end products, Advanced; TGFβ;CTGF

　　糖尿病肾病(DN)的发病机制是以高血糖为启动因素所诱导的各种血管活性物质、生长因子、细胞介质等综合作用的结果，其中转化生长因子β(TGFβ)和结缔组织生长因子(CTGF)的作用尤其受到关注。持续高血糖状态下体内蛋白质能发生一系列非酶促糖基化反应，最后形成的糖基化终末产物(AGEs)在DN发生机制中具有重要意义〔1〕，AGEs可诱导TGFβ和CTGF等基因表达异常。过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)是核内受体转录因子超家族成员之一，在脂肪生成、胰岛素敏感性、细胞周期调节及细胞分化中起重要作用，抗糖尿病药物胰岛素增敏剂四氢噻唑烷二酮类药物 (TZDs)如罗格列酮(Rosiglitazone，RSG)是PPARγ的特异性激活剂。RSG不仅能减轻糖尿病肾小球细胞外基质合成，还能增加细胞外基质的降解〔2，3〕。然而PPARγ是否影响AGEs引起的细胞TGFβ和CTGF基因表达异常目前尚不清楚。本实验通过体外培养大鼠肾系膜细胞，研究AGEs对肾小球系膜细胞TGFβ和CTGF表达的影响及PPARγ激活剂的调节作用，探讨PPARγ激活剂对DN保护作用的具体机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 DMEM培养基(Gibco)，小牛血清(Hycolon)，HEPEs(Sigma)，牛血清白蛋白(BSA，组分Ⅴ，Sigma)、胰酶(Amresco)、DAB(Amresco)，Trizol，SupperⅡ逆转录酶(Gibco)，DNA聚合酶(Trans Gene)。DNA Marker(大连宝泰克公司)，RSG(天津史克必成公司)。PPARγ阻断剂GW9662(Alexis Biochemicals)，其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 AGE修饰牛血清白蛋白的制备 BSA10 g/L，葡萄糖0.5 mol/L，青霉素1×105U/L，链霉素1×105U/L，EDTA 1 mmol/L溶于PBS(pH 7.2)，滤过除菌，37℃避光孵育2个月，透析除糖后制成AGE修饰牛血清白蛋白(AGEBSA);同样浓度BSA孵育于不加葡萄糖的体系中，作为对照。荧光分光光度计测定两种白蛋白AGEs含量(370 nm/440 nm)分别为 20.5、3.1任意荧光单位。

　　1.3 肾小球系膜细胞的分离、培养及鉴定〔4〕 Wistar大鼠(由本校实验动物部提供)体重120～150 g，麻醉后无菌取出肾脏，去除包膜，分离肾皮质，剁碎后移至100目钢网上用注射器芯轻轻碾压，再依次通过140和220目尼龙网，收集220目上的肾小球，Ⅳ型胶原酶(7.5×105 U/L)37℃消化20 min，接种在一次性塑料培养瓶中，5% CO2、37℃培养。培养液为含20%小牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素、2.38 g/L HEPEs的DMEM。开始4 d勿动培养瓶，第5天首次换液，约2 w系膜细胞长满后0.25%胰酶0.005EDTA消化传代。根据细胞形态学特征及抗胸腺抗体免疫组化检测鉴定为系膜细胞，实验使用第5～10代细胞。

　　1.4 实验分组 取传代至5～10代的细胞进行实验。

　　1.4.1 不同浓度AGEs对系膜细胞TGFβ、CTGF mRNA含量的影响 将细胞消化后，计数，以1×104个/孔接种至24孔板。待细胞80%融合时用含0.5%血清的培养基同步生长24 h后，加入含AGEBSA及BSA的无血清培养基，浓度分别为0、25、50、100、200、400 μg/ml。48 h后用Trizol收集系膜细胞，80℃冻存提取RNA。

　　1.4.2 不同浓度RSG对AGEs引起的TGFβ、CTGF mRNA含量的影响 将细胞消化后，计数，以1×104个/孔接种至24孔板。待细胞80%融合用0.5%血清的培养基同步24 h后，每孔加入含100 μg/ml AGEs和不同浓度RSG的无血清培养基，RSG的浓度分别为0、1.25、2.5、5和10 μmol/L。48 h后用Trizol收集系膜细胞，80℃冻存提取RNA。

　　1.4.3 PPARγ阻断剂(GW9662)对AGEs引起的TGFβ、CTGF mRNA含量的影响 将细胞消化后，计数，以1×104个/孔接种至24孔板。待细胞80%融合用0.5%血清的培养基同步24 h后，每孔加入浓度为10 μmol/L的GW9662无血清培养基，其中一组在GW9662处理1 h 后，加入含100 μg/ml AGEs和10 μmol/L RSG的无血清培养基。48 h后用Trizol收集系膜细胞，80℃冻存提取RNA。

　　1.5 RTPCR检测GAPDH、TGFβ和CTGF mRNA的表达 Trizol 提取系膜细胞总RNA，各取1 μg mRNA以oligo dT为引物在SuperⅡ 逆转录酶的作用下逆转录成cDNA。

　　1.5.1 引物序列 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH引物序列：正义5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，反义5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度为452 bp;TGFβ引物序列：正义5′CCAAGGAGACGGAATACAGG3′，反义5′GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG3′，扩增片段长度为412 bp;CTGF引物序列：正义5′CTAAGACCTGTGGAATGGGC3′，反义5′CTCAAAGATGTCATTGTCCCC3′，扩增片段长度为383 bp。

　　1.5.2 PCR条件 94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，72℃10 min。

　　1.5.3 结果分析 取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射反射分析仪上拍照，以GAPDH校正作相对量分析，应用计算机图像分析系统测算TGFβ/GAPDH、CTGF/GAPDH 灰度比值。

　　1.6 统计学处理 实验结果以x±s表示，统计推断使用方差分析，组间比较使用LSD、DUNCAN等进行显著性检验，使用SPSS13.0软件进行计算。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度AGEs对系膜细胞TGFβ、CTGF mRNA含量的影响。AGEs(0～400 μg/ml)能明显增加系膜细胞中TGFβ、CTGF mRNA的含量。与相应浓度BSA比较，除TGFβ BSA 200 μg/ml组外，100～400 μg/ml AGEs能明显刺激TGFβ、CTGF mRNA 表达。其相对灰度值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

　　1～6：AGEs 0～400 μg/ml，M：Marker DL2000，7～12：BSA 0～400 μg/ml

　　Marker DL2000自上而下分别为：2 000、1 000、750、500、250、100 bp

　　2.2 不同浓度RSG对100 μg/mlAGEs引起的TGFβ、CTGF mRNA含量变化的影响。与AGEs组比较，RSG各浓度组中随RSG浓度的增加，TGFβ、CTGF mRNA含量均呈下降趋势，其中RSG(2.5～10 μmol/L)较高剂量组TGFβ mRNA含量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　1～5：RSG 0～10 μmol/L，M：Marker DL2000

　　Marker DL2000自上而下分别为：2 000、1 000、750、500、250、100 bp

　　2.3 PPARγ阻断剂(GW9662)对100 μg/ml AGEs引起的TGFβ、CTGF mRNA含量的影响。与RSG 10 μmol/L组比较，GW9662 10 μmol/L组TGFβ、CTGF mRNA的含量均呈增加趋势，但差异无统计学意义;GW9662 10 μmol/L作用1 h，再加入10 μmol/L RSG组，TGFβ mRNA的含量呈增加趋势，CTGF mRNA含量有所下降，其差异无统计学意义。

　　1：RSG 10 μmol/L，2：GW9662 10 μmol/L，3：GW9662 10 μmol/L+RSG 10 μmol/L，M：Marker DL2000

　　Marker DL2000自上而下分别为：2 000、1 000、750、500、250、100 bp

　　3 讨 论

　　过氧化物酶体增殖体激活受体(PPARs)是一类甾体激素受体，目前已发现PPARα、PPARβ和PPARγ三种类型，其中PPARγ被认为是一种新的治疗肾脏疾病的靶点。许多物质都能激活PPARγ，抗糖尿病药物胰岛素受体增敏剂四氢噻唑烷二酮类药物(TZDs)如RSG是PPARγ最重要的外源性激活剂，在毫微克水平即可激活PPARγ。糖尿病肾病实验研究证实，TZD类药物可显著降低蛋白尿，延缓糖尿病肾病的发展，而且可减少糖尿病肾小球ECM蛋白和mRNA的表达〔5，6〕。在以前的研究中显示，系膜细胞是肾小球内的固有细胞，与肾小球ECM含量密切相关，大鼠肾系膜细胞表达PPARγ mRNA，说明大鼠系膜细胞有PPARγ表达，PPARγ激活剂罗格列酮可以作用于系膜细胞。

　　作为一种强效的致纤维化因子，TGFβ表达升高与多种原因引起的肾纤维化密切相关，被认为是肾纤维化最重要的效应因子之一。实验证明，TGFβ能够促进成纤维细胞增殖和调节ECM合成〔7〕。TGFβ还能够减少MMPs表达及促进纤溶酶激活物抑制物和TIMPs的合成而减少ECM降解。CTGF是近年来倍受重视的一种生长因子，具有较特异的促组织纤维化效应，即促进间充质细胞如成纤维细胞增殖和ECM合成增加。研究表明，CTGF除了本身的直接效应外，还可作为TGFβ的下游效应因子介导其部分促纤维化作用。

　　本研究是为了检测PPARγ是否影响AGEs引起的系膜细胞TGFβ和CTGF基因表达异常。我们发现AGEs可引起系膜细胞TGFβ和CTGF mRNA含量增加，并且基本上呈浓度依赖性。选择AGEs最佳作用浓度100 μg/ml，给予罗格列酮后，系膜细胞TGFβ mRNA含量明显下降， CTGF mRNA也呈下降趋势。为进一步证明PPARγ激活能够减轻AGEs对系膜细胞TGFβ和CTGF mRNA表达的影响，我们也检测了PPARγ阻断剂(GW9662)对其的影响。结果表明，加入PPARγ阻断剂后TGFβ、CTGF mRNA的含量均呈增加趋势。进一步证明了PPARγ激活对糖尿病肾脏具有一定的保护作用。

　　系膜细胞分泌多种ECM成分，PPARγ激活对不同ECM成分的作用不同，而且ECM的量由合成和降解两个过程决定，多种因子参与其中，过程较为复杂。在今后的研究中，拟进一步检测ECM成分mRNA水平及基质降解酶活性，于阐述其具体机制。总之，本研究表明罗格列酮能明显减轻AGEs大鼠系膜细胞TGFβ和CTGF mRNA的表达，提示PPARγ激活可能通过影响TGFβ和CTGF的表达，从而改善肾小球细胞外基质积聚,在糖尿病时起到肾脏保护作用。

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