羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究

　　作者：陈少强， 林建华 作者单位：福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系，福州 350004;附属第一医院骨科，福州 350005

　　【摘要】目的 探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的可行性和最适条件。 方法 清洁型SD大鼠20只，用密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化、培养大鼠MSCs，取长满25 cm×25 cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs，用2.5，5，10，20，40 μmol/L的CFSE分别作用1，5，10，15，20 min后染色，通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。采用MTT法检测最佳条件CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力。 结果 浓度10 μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为MSCs染色、观察和研究的最佳条件。此条件下，CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。 结论 活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法，浓度10 μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为CFSE标记大鼠MSCs的最佳条件。

　　【关键词】 荧光素; 乙酰乙酸盐类; 骨髓细胞; 间质干细胞; 染色与标记; 大鼠

　　骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓内的非造血干细胞，具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点，是组织工程和细胞移植治疗的最佳种子细胞[12]。为研究MSCs的移植疗效，需对MSCs在体内的存活、迁移、分布及增殖、分化进行监测，因此需要有效的标记方法区别供体细胞和受体细胞。已有的标记物如放射性探针、荧光素探针和绿色荧光蛋白等用于MSCs标记，但在应用过程中也存在诸多问题。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(5，6，2-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester，CFSE)是一种可穿过细胞膜、自动而且不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合的荧光染料，近年来在神经科学和免疫学已有广泛应用[3]。但CFSE对不同细胞体外染色的标记时间和标记浓度不同[4]。为探讨CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度，笔者应用CFSE对体外培养的大鼠MSCs染色进行系统研究，报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 选用清洁级健康雄性SD大鼠20只，2～3月龄，体质量150～250 g[福建医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(闽2004-0008)]。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清FBS(美国HyClone公司);胰蛋白酶(Trypsin 1∶250，Amersco);PBS、FicollPaque分离液(美国Pharmacia公司);染料CFSE(美国Sigma公司);荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD34PE、CD45FITC、CD29FITC、CD90FITC(美国PharMingen公司);Thermo Forma CO2孵育箱(3111，USA)，Beckman counter Epics XL流式细胞仪(美国BD公司)，倒置相差显微镜(IX70，德国OLYMPUS公司)，倒置相差荧光显微镜(CoiCB5203，德国OLYMPUS公司)，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MSCs的培养、传代与鉴定 大鼠氯胺酮(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培养液(含10 000 U肝素)冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含FicollPaque分离液3 mL的试管内梯度离心(2 000 r/min，30 min)，吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37 ℃、饱和湿度、体积分数为0.05的CO2，培养液为DMEM(含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)。每3～4 d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞，传代并检测CD34、CD45、CD29、CD90。

　　1.2.2 CFSE染色及最佳条件筛选 2.5 mg CFSE用500 μL二甲基亚枫(DMSO)溶解，制成10 mmol/L的储存液，放于-20 ℃冰箱内保存。临用前取适量，用MSCs培养基分别稀释成2.5，5，10，20，40 μmol/L的不同浓度。取长满25 cm×25 cm 培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs 26瓶，其中1瓶做等量空白对照，其余25瓶分5组，每组5瓶，分别加入含不同浓度CFSE的MSCs培养基5 mL，置37 ℃培养箱分别孵育1，5，10，15，20 min。用PBS漂洗3次，490 nm激发波长荧光显微镜下观察CFSE标记情况。标记率为：

　　标记率=暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见的细胞数×100%

　　530 nm发射波长激光共聚焦显微镜下测定细胞荧光强度(每瓶随机取10个细胞)。随后用0.25%胰酶(含0.1%EDTA液)1 mL消化，离心管离心(1 000 r/min,2 min)。弃去上清，用含10%FBS培养基6 mL吹打成单细胞悬液。每瓶取1 mL悬液进行台盼蓝染色，观察MSCs的存活率：

　　存活率=光镜下活细胞数/总细胞数×100%

　　其余悬液按1∶2的比例接种于25 cm×25 cm培养瓶中，24 h后观察记录MSCs的贴壁率：

　　贴壁率=(倒置相差显微镜下接种细胞数-未贴壁的细胞数)/接种细胞数×100%

　　上述步骤重复4次，通过统计学分析筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。

　　1.2.3 标记细胞增殖能力检测 取第3代MSCs接种于96孔板中，每孔体积100 μL，细胞数为1×103。实验分2组：CFSE标记组(选用最佳标记时间和标记浓度的CFSE进行标记)和未标记组，每组35孔，每天相同时间每组各取5孔细胞，加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),37 ℃培养箱孵育4 h后用全自动酶标仪在490 nm波长测定其光吸收值D490，连续7 d，并绘制生长曲线。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包对所得数据进行t检验和单因素方差分析，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MSCs的体外培养与鉴定 MSCs培养24 h后逐渐贴壁，其他血细胞通过换液逐渐除去，此时贴壁细胞共同特点是呈巨单核细胞，细胞形态不一，可有梭形、多角形或星芒状突起，为单个或多个细胞的克隆，细胞增殖迅速。12～14 d，>90%细胞融合，融合细胞均呈梭形(图1)，原代可获得1×106～2×106个MSCS。体外扩增5代细胞数约为1×1011个MSCs。流式细胞仪检测10份第2代细胞样本，结果显示：CD34、CD45表达阴性，CD29、CD90表达阳性。

　　图1 原代大鼠骨髓间质干细胞形态(相差显微镜，×100)(略)

　　Fig 1 Rat’s MSCs of primary generation(phase contrast microscope, ×100)

　　2.2 CFSE标记结果 CFSE标记各组MSCs后，荧光显微镜下观察，所有细胞都被标记呈绿色荧光，标记率达100%。整个细胞包括细胞膜、细胞质和细胞核都被标记上绿色荧光(图2A,2B)。台盼蓝染色结果表明，CFSE标记的各组MSCs的存活率为100%(图2C)。

　　A. 明视野(倒置荧光显微镜，×100);B. 暗视野(倒置荧光显微镜，×100);C. 台盼蓝染色(光学显微镜，×40).

　　图2 羧基荧光素乙酰乙酸标记的第三代大鼠骨髓间质干细胞(略)

　　Fig 2 Rat’s MSCs of 3rd generation labeled with CFSE

　　2.3 最佳染色条件筛选结果 CFSE标记各组MSCs的贴壁率和荧光强度分别见表1，2。5种浓度的CFSE分别作用1,5,10,15,20 min，其细胞贴壁率差别具有统计学意义，作用15 min和20 min组细胞贴壁率明显低于其它3组(F=62.429，P<0.01)，进一步单因素方差分析显示，1，5，10 min 3组差别无统计学意义(F=2.176,P>0.05)，而20 min组细胞贴壁率明显低于15 min组(F=67.826，P<0.01)。各组MSCs的荧光强度差别具有统计学意义，作用10，15，20 min组荧光强度明显高于其它2组(F=87.571，P<0.01)，进一步单因素方差分析显示，10，15，20 min 3组差别无统计学意义(F=2.478,P>0.05)，而1 min和5 min组差别有显著性意义(F=147.357，P<0.01)，5 min组荧光强度明显高于1 min组。因此选择10 min作为最佳染色时间。5种不同浓度的CFSE染色10 min，其细胞贴壁率的单因素方差分析显示差别具有统计学意义，2.5，5，10 μmol/L组细胞贴壁率明显高于其它2组(F=72.265，P<0.01)，进一步单因素方差分析显示，2.5，5，10 μmol/L 3组细胞贴壁率差别无显著性意义(F=1.957,P>0.05);5种不同浓度的CFSE染色10 min，其荧光强度的单因素方差分析显示差别具有统计学意义(F=78.313，P<0.01)，荧光强度随着浓度增加而增强。因此选择10 μmol/L作为最佳染色浓度。

　　2.4 最佳条件CFSE标记的MSCs的增殖能力 最适条件CFSE标记组和未标记组的光吸收值D490差别无统计学意义(配对t检验，P>0.05)，表明在最适条件下，CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。2组的生长曲线见图3。

　　表1 不同浓度、不同作用时间羧基荧光素乙酰乙酸标记的髓间质干细胞贴壁率(略)

　　Tab 1 Adhesive rate of MSCs after labeled by CFSE with different concentrations and different incubation time

　　n=50. 表中数据为%.

　　3 讨论

　　为了监测MSCs在体内的存活、迁移、分布、增殖及分化情况，在体外需对MSCs进行必要的标记。常用的标记方法包括放射性同位素标记、抗原标记、荧光染料标记和绿色荧光蛋白标记等，但它们在应用过程中也存在不少问题[5]。同位素标记由于存在检测方法复杂、放射性污染等不足，随着抗原标记、荧光染料标记和绿色荧光蛋白标记等方法的出现，该方法已很少应用[5]。抗原标记法主要是指溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyurodine,BrdU)标记法，它虽然具有安全性好、敏感性高和细胞毒性小等特点，而且BrdU作为生长刺激物可提高MSCs的多分化潜能，但它存在标记率不高、荧光强度容易减弱等缺点[6]，而且免疫组织化学检测存在费时费力问题。现有的荧光染料标记法主要有4，6联脒2苯基吲哚(4，6diamidino2phenylindole，DAPI)和Hoechst(包括Hoechst33342和Hoechst33258)，它们具有细胞毒性小、技术简单、细胞通透性高、标记率高和荧光强度强等特点，但它们存在荧光表达时间短、容易被低分化细胞(如干细胞)排出胞外而不显色等不足[7]，而且只标记细胞核，不利于观察整个细胞。绿色荧光蛋白标记，特别是增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记，是目前用于标记MSCs的最常用方法，它能标记出整个细胞，且具有稳定性好、绿色荧光保持时间长、细胞毒性小和标记率高等优点。EGFP标记MSCs的方法通常是建立转基因动物或通过质粒转染，前者虽细胞标记率高达100%，且具有遗传稳定性，但由于建立转基因动物方法复杂，成功率很低，而且价格昂贵，不适合大面积推广。现普遍采用的质粒转染法包括脂质体转染法和逆转录病毒介导转染法两种，然而阳离子脂质体在体内使用时，能在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致剧烈的毒性反应[8];另外病毒的安全性问题阻碍了它的推广应用[9]，而且病毒载体制备方法复杂，价格昂贵也严重限制了其在基因转染中的应用。CFSE是一种亲脂性非极性分子活体染料，可自由穿过细胞膜，进入细胞内被酯酶转化为带负电荷的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，并释放荧光。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞，是理想的活细胞荧光标记物[3]。CFSE神经干细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞和肝细胞等多种细胞的染色，表现出操作简单、使用方便、安全无辐射、细胞标记率高、细胞毒性低、观察期长、不渗漏等优点[3]。国内付霞霏等报道大鼠MSCs以5 μmol/L浓度的CFSE标记30 min能产生较好的标记效果，且不影响细胞的活力及增殖特性，并认为MSCs经CFSE标记3月后仍可检测到[10]。林峰等应用CFSE标记MSCs方法对MSCs移植治疗心肌梗死实验进行观察，也证明具有很好的示踪效果[11]。

　　表2 不同浓度、不同作用时间羧基荧光素乙酰乙酸标记的骨髓间质干细胞细胞荧光强度(略)

　　Tab 2 Fluorescence intensity of MSCs after labeled by CFSE with different concentrations and different incubation time

　　图3 羧基荧光素乙酰乙酸标记组和未标记组生长曲线的比较(略)

　　Fig 3 Growth curve of labeled and nonlabeled MSCs

　　已有研究证实，CFSE标记不同的细胞，其最佳标记浓度和标记时间不同[4]。尽管已有应用CFSE标记MSCs的报道[1011]，但未对CFSE标记MSCs的最佳条件进行研究。本实验结果显示，在荧光显微镜下，CFSE标记的MSCs呈绿色荧光，标记率达100%，整个细胞包括细胞膜、细胞质和细胞核都被标记上绿色荧光。台盼蓝染色结果也表明，CFSE标记的各组MSCs的存活率为100%，证实CFSE是MSCs理想的荧光标记物。细胞贴壁率高低反映细胞粘附和生存的能力，染色效果好但影响细胞贴壁率的染料对研究其对细胞的染色效果是毫无意义的。本研究对不同浓度CFSE染色效果观察显示，荧光强度随着浓度增加而增强，但>10 μmol/L会导致MSCs的贴壁率降低。对不同时间CFSE染色效果观察显示，荧光强度在作用1 min时较弱，在10 min内随着时间延长而增强，作用时间超过10 min后，荧光强度随时间延长未见明显改变，而MSCs的贴壁率开始降低。MTT法检测结果也显示，在10 μmol/L的CFSE浓度、37 ℃孵育10 min的染色条件下，大鼠MSCs的增殖能力未受到明显影响。经过对不同浓度CFSE和不同时间细胞染色结果和细胞贴壁率观察，结合细胞增殖能力的检测，显示长满培养瓶瓶底的大鼠MSCs，10 μmol/L的CFSE浓度、37 ℃孵育10 min为其最佳染色条件。本实验结果为进一步MSCs标记体内移植的研究提供了科学依据和实验基础。

　　【参考文献】

　　[1] Jorgensen C,Djouad F,Apparailly,et al. Engineering mesenchymal stem cells for immuntherapy[J]. Gene Therapy, 2003,10(3)：928931.

　　[2] Miura M, Miura Y,Sonoyama W,et al. Bone marrowderived mesenchymal stem cells for regenerative medicine in craniofacial region[J]. Oral Dis,2006,12(6)：514518.

　　[3] Baan C C,Mast B J,Klepper M,et al. Differential effect of calcineurin inhibitors,antiCD25 antibody and rapamycin on the indution of FOXP3 in human T cells[J]. Transplantation, 2005,80(1)：110117.

　　[4] 洪介民，黎庆梅，吕海峰，等. CFSE标记细胞的影响因素探讨[J]. 广东药学院学报，2006，22(5)：541543.

　　[5] 许 剑，徐格林，刘新峰. 骨髓基质干细胞的标记示踪技术及其应用[J]. 中国临床神经科学，2006，14(2)：197201.

　　[6] Sakai T,Li R K,Weisel R D,et al. Autologous heart cell transplantation,improve cardiac function after myocardial injury[J]. Ann Thorac Surg, 1999,68(7)：20742081.

　　[7] Dunnwald M,Chinnathambi S,Alexandrunas D,et al. Mouse epidermal stem cells proceed through the cell cycle[J]. J Cell Physiol, 2003,195(1)：194201.

　　[8] Ishiwata N, Suzuki S, Ando, et al. Characteristics and biodistribution of cationic liposomes and their DNA complexes[J]. J Control Rel, 2000,69(1)：139148.

　　[9] Arhsall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector[J]. Science, 2000,286(3)：22442245.

　　[10] 付霞霏，何援利. 大鼠间充质干细胞体外分离培养及CFSE标记[J]. 解放军医学杂志，2007，32(5)：464466.

　　[11] 林 峰，廖崇先，叶韵斌，等. 骨髓细胞梗死心肌移植对心肌细胞结蛋白的影响[J]. 中华实验外科杂志，2003，20(7)：855858.