人KiSS1和p27Kip1基因在骨肉瘤MG63细胞株中的共表达
发表时间：2010-10-29 浏览次数：331次
作者：白国昌， 林建华 作者单位：福建医科大学 附属第一医院骨科，福州 350004
【摘要】目的 克隆肿瘤转移抑制基因KiSS1和细胞周期依赖性激酶抑制剂基因p27Kip1的表达序列，应用内部核糖体插入位点(IRES) 序列构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，测序鉴定，并获得稳定表达目的蛋白的细胞株。 方法 利用RTPCR从人正常胎盘组织中获得KiSS1和p27Kip1基因开放阅读框的cDNA序列，将两目的基因的cDNA序列重组至pIRES载体，构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，应用脂质体转染骨肉瘤MG63细胞，并通过RTPCR和Western blot检测目的蛋白的表达情况。 结果 经PCR、酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入pIRES载体上的两个片段均为目的基因开放阅读框的核苷酸序列，KiSS1和p27Kip1蛋白在转染后的细胞中有表达。 结论 成功构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，获得稳定表达KiSS1和p27Kip1蛋白的细胞株，为进一步观察目的基因对骨肉瘤细胞体内外效应奠定基础。
【关键词】 骨肉瘤 重组 遗传 克隆 分子 基因 肿瘤抑制 细胞周期蛋白质类 肿瘤细胞 培养的
KiSS1基因是一种肿瘤转移抑制基因，通过和MMP9基因相互作用来增加细胞间的黏附并抑制肿瘤细胞的转移[12]。p27Kip1蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)的负性调控因子，文献报道在骨肉瘤等多种恶性肿瘤中，其表达降低并与多种肿瘤恶性程度相关[3]。为研究此两种基因在抑制骨肉瘤增殖和转移中是否存在协同作用，笔者克隆KiSS1和p27基因，通过真核表达载体pIRES，构建能分别表达KiSS1和p27Kip1 蛋白的共表达载体，应用脂质体转染骨肉瘤细胞，经G418筛选获得能稳定表达目的基因的骨肉瘤MG63细胞，观察目的基因对骨肉瘤细胞的体内外效应。
1 材料与方法
1. 1 材料
1.1.1 试剂 真核表达载体pIRES(美国Clontech公司)。大肠杆菌DH5α为本室保存。逆转录试剂盒、限制性内切酶、T4DNA ligase(美国Fermentas公司)。高保真PfuDNA聚合酶(美国BioFlux公司)，细胞总RNA抽提试剂Trizol Reagent、脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogene公司)，DNA纯化试剂盒及胶回收试剂、质粒小抽试剂盒(北京天根生化)。兔抗人KiSS1、兔抗人p27、兔抗人βTubulin一抗(美国Santa Cruz公司)，HRP标记的鼠抗兔二抗(美国Pierce公司)。
1.1.2 主要仪器 Gene Amp PCR System(9700型，美国Perkin Elmer 公司)，Gel Doc凝胶成像仪(2000型，美国BioRad公司)，DU800紫外分光光度仪(美国Beckman 公司)。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 分别根据Genebank报道人KiSS1基因(登录号AY117143)和p27Kip1(登录号AF247551)基因的ORF设计引物。为了将目的基因克隆至真核载体pIRES和提高酶切效率上，在上游引物和下游引物5′端加上含有限制性内切酶和相应保护碱基的接头。序列(由上海鼎新生物公司合成)：
KiSS1基因
上游：5’CCGCTCGAGATGAACTCACTGGTTTCTTG3’
下游：5’CGACGCGTCACTGCCCCGCACCTG3’
p27Kip1基因
上游：5’ACGCGTCGACATGTCAAACGTGCGAGTGTC3’
下游：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTACGTTTGAC
GTCTTCTG3’
1.2.2 KiSS1、p27Kip1基因的获得 RTPCR从胎盘组织中克隆两个目的基因，术中取材，选取胎盘组织约0.3 g，采用Trizol法抽提总RNA。建立逆转录合成单链cDNA：反应体系：RNA 2 μg，Oligo(dT) 1 μL DEPC处理水10 μL，70 ℃水浴5 min后迅速入冰降温，加入5×Buffer 4 μL，4×dNTP 2 μL，RNasein 1 μL，37 ℃水浴5 min，冰浴，离心。加入MMLV逆转录酶1 μL(总体积20 μL)，混匀离心，42 ℃水浴60 min。70 ℃水浴10 min终止反应。PCR反应体系：总体积50 μL，由引物KiSS1R、KiSS1F各1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPMixture4 μL，高保真pfu酶1.25 μL，模板DNA 1 μL ，ddH2O 37.5 μL PCR扩增双链cDNA反应条件：KiSS1为94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。p27为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压110 V，电流强度20 mA)，检测PCR产物，对产物进行纯化。
1.2.3 pIRESKiSS1载体的构建 对KiSS1纯化产物和pIRES质粒进行双酶切(XhoI和MIuI)，酶切产物回收。用T4DNA连接酶将片段KiSS1和载体酶切片段。转化大肠杆菌感受态DH5α，并通过带有氨苄霉素(100 μg/mL)的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌收集菌液，采用TIAGEN质粒少量抽提试剂盒抽提质粒，用XhoI和MIuI进行双酶切，酶切产物于1%琼脂糖凝胶电泳分离，将酶切阳性者克隆，用该质粒的通用引物pIRESF测序，测序成功后获得重组质粒pIRESKiSS1。
1.2.4 pIRESKiSS1p27Kip1的构建 将pIRESKiSS1和经PCR扩增、胶回收纯化后获得的p27Kip1分别用上游SalI和下游NotI双酶切后，纯化连接转化，酶切鉴定，并通过该质粒的通用引物pIRESR测序鉴定后，命名重组质粒为pIRESKiSS1p27Kip1。
1.2.5 转染骨肉瘤MG63细胞 培养MG63细胞80%融合时进行转染，取重组质粒pIRESKiSS1p27kip11 μg以无血清的DMEM稀释至250 μL。取Lipofectamine2000 10 μL溶于250 μL DMEM中，室温孵育5 min，将上述液体混匀室温孵育20 min，加入MG63细胞中，放置37 ℃、6 h后小心吸去上清，更换为含10% FBS、DMEMH继续培养30 h。
1.2.6 筛选骨肉瘤MG63细胞 通过脂质体将重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1转染到骨肉瘤MG63细胞内，培养36 h后更换含10%FBS培养液，并加入G418使其浓度达500 μg/mL，继续培养3～4 d，待细胞大部分死亡后，调整G418浓度至300 ng/mL，继续培养，约持续培养4周左右单克隆形成后挑取一单克隆传入96孔板中待其长满后传入6孔板中继续扩增。筛选得到的细胞为pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞和转染空载体的pIRES MG63细胞。
1.2.7 RTPCR检测MG63细胞、pIRES MG63细胞、pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞KiSS1和p27kip1mRNA的表达 Trizol法抽提总RNA，建立逆转录合成单链cDNA反应体系，获得各组细胞cDNA。PCR反应：反应体系cDNA 2 μL，dNTP 5 μL，上下游引物混合物2 μL，buffer 5 μL，TagDNA Polymerase 0.5 μL，定容至25 μL。反应条件：KiSS1和p27kip1同前。
以βactin为内参照，序列
F：5’ATTCCTATGTGGGCGACGAG3’
R：5’AGAGGCGTACAGGGATAGCA3’
反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。反应结束后1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。
1.2.8 Western blot法检测转染后MG63细胞、pIRES MG63细胞、pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞KiSS1和p27kip1基因的表达 收集培养板内细胞，于15%分离胶、5%浓缩胶行SDSPAGE电泳，湿式转膜(120 mV，120 min)，PVDF膜(0.22 μm)经脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，分别用兔抗人KiSS1/ p27kip1一抗(1∶200)，室温孵育2 h，TBST洗10 min×3次，辣根过氧化物酶标记鼠抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗10 min×3次，依ECL发光试剂盒说明书曝光、显影。
2 结 果
2.1 抽提总RNA 通过Trizol法抽提胎盘组织的总RNA，从琼脂糖电泳分析清晰可见28s/18s/5s条带，其中28s∶18s条带的浓度比≈2∶1。表明所提的RNA无降解，用紫外分光光度计分析，其D260nm/D280nm>1.8，无DNA 污染，相对较纯，可以用于逆转录。
2.2 KiSS1、p27Kip1基因片段的克隆 用KiSS1或p27Kip1上下游引物分别经PCR扩增获得KiSS1基因和p27Kip1基因ORF片段，经琼脂糖电泳分析，其片段大小分别约400 bp和600 bp，与预期的KiSS1基因和p27Kip1基因ORF片段的438 bp和597 bp大小相符(图1)。
2.3 重组质粒pIRESKiSS1的构建和鉴定 将从胎盘组织中克隆的KiSS1基因的ORF片段连接到pIRES载体上，构建成pIRESKiSS1，经限制性内切酶XhoI和MIuI双酶切分析，产生438 bp的目的片段和6.1 kb的载体两个片段(图2)，经DNA测序分析，证实目的基因KiSS1插入后，其开放阅读框无改变。并将全序列与Gene Bank上已知序列进行BLAST分析，与从非转移性黑色素瘤细胞株中克隆的KiSS1基因的ORF序列同源性达100%。 1:Marker;2:目的基因.
2.4 重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1的构建和鉴定 将从胎盘组织中克隆的p27Kip1基因的ORF片段连接到已经酶切和DNA测序分行确证的载体pIRESKiSS1上，构建成重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1。分别应用限制性内切酶SalI与NotI和MIuI与XhoI双酶切后，可见438 bp的 KiSS1和597 bp的p27Kip1目的片段(图3)，提示目的基因片段已成功插入载体。经DNA测序分析证实目的基因p27Kip1插入方向正确，将全序列与Gene Bank上已知序列进行BLAST分析，与人p27Kip1基因的ORF序列同源性达100%。
2.5 pIRESKiSS1p27Kip1在骨肉瘤MG63细胞中的表达和表达产物的鉴定 重组载体pIRESKiSS1p27Kip1和空载体pIRES分别转染骨肉瘤MG63细胞，转染后48 h，在G418筛选培养基中生长的细胞出现生长抑制，细胞开始死亡，细胞数量减少，G418筛选2周后转染pIRESKiSS1p27kip1载体、pIRES空载体的细胞出现阳性克隆，3周后细胞呈集落生长，6周后细胞长满。
用Trizol法分别抽提转染pIRESKiSS1p27kip1载体、pIRES空载体的细胞和MG63细胞的总RNA，用RTPCR分别检测三株细胞的KiSS1和p27kip1mRNA的表达水平，三株细胞中仅在pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞中检测出KiSS1基因的转录产物(图4)，而MG63细胞、pIRESMG63细胞中未检测出KiSS1基因转录产物，各组细胞均存在p27kip1基因转录产物(图5)。
用Western blot分析pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞、pIRES MG63细胞和MG63细胞KiSS1和p27kip1蛋白质表达水平，仅在pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞组中存在KiSS1蛋白质的表达(图6)，而MG63细胞、pIRES MG63细胞组中无KiSS1蛋白质的表达。各组细胞均存在p27kip1蛋白质的表达，其中pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞组p27蛋白表达明显升高。
3 讨 论
目前，通过脂质体进行及基因转染，药物筛选得 1:Marker;2:pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞;3:pIRESMG63细胞;4:MG63细胞.到稳定转染细胞株的方法仍然是体外研究基因功能的常用方法。为进一步明确所构建的载体是否能在细胞内表达，笔者通过脂质体将所构建的载体转染到骨肉瘤MG63细胞中，经过最佳G418浓度筛选，获得了pIRESKiSS1p27kip1 MG63、pIRES MG63和MG63三种细胞。在通过RTPCR和Western blot对检测目的基因是否表达检测后发现，由于KiSS1基因在骨肉瘤MG63中表达缺失，故仅在pIRESKiSS1p27kip1 MG63细胞组中检测到KiSS1基因在mRNA和蛋白质水平上均表达。虽然p27基因在骨肉瘤MG63中存在mRNA和蛋白质的表达，但其蛋白表达量较转染共表达载体的细胞明显降低。这表明转染共表达载体细胞即pIRESKiSS1p27kip1 MG63细胞能稳定表达KiSS1和p27kip1蛋白。因此，获得了能同时稳定表达KiSS1和p27蛋白的细胞株，为进一步探讨表达的KiSS1和p27 在体外抑制骨肉瘤细胞增殖、转移中的协同效应奠定一定基础。
【参考文献】
[1] Lee J H,MieleM E,Hicks D J,et al. KiSS1,a novel human malignant melanoma metastasissuppressor gene [J]. J Natl Cancer Inst, 1996,88(23):17311737.
[2] Yan C,Wang H,Boyd D D. KiSS1 represses 92kDa type Ⅳ collagenase expression by downregulating NFkappa B binding to the promoter as a consequence of Ikappainduced block of p65 /p50 nuclear translocation [J]. J Biol Chem, 2001,276 (2):11641172.
[3] 黄守行,林建华,张怡元,等. p27Kip1基因及其蛋白在骨肉瘤中的表达及其意义[J]. 中国骨肿瘤骨病, 2008,7(1):1922.
