骨质疏松症与血清转化生长因子β、瘦素的关系

　　作者：张磊，　　戴冀斌，　　施永彦，　　崔操

　　[摘要]目的：研究骨质疏松症与血清瘦素和转化生长因子β(TGF-β)浓度的关系。方法：酶联免疫吸附法(ELISA)检测24例骨质疏松症患者血清中瘦素和TGF-β水平，并与正常人对照;计算血清瘦素、TGF-β与骨密度的相关性。结果：骨质疏松症患者TGF-β水平较对照组明显降低(P<0.05)，但血清瘦素与对照组无显著差异(P>0.05)。血清TGF-β与骨密度呈正相关，瘦素与骨密度无相关性。结论：TGF-β水平降低可能是骨质疏松症发病的原因之一，而无直接证据表明瘦素水平变化与骨质疏松症发病有相关性。

　　[关键词]骨质疏松症;瘦素;转化生长因子β;酶联免疫吸附检测

　　Relationship Between Osteoporosis and Serum Transforming Growth Factor β and Leptin

　　ZHANG Lei,DAI Ji-Bin,SHI Yong-yan,CUI Cao.

　　(Faculty of Anatomy and Embryology,School of Medicine,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430071;Department of Trauma Orthopaedics,Renmin Hospital,Department of Orthopaedics,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objective To explore the relationship between osteoporosis and leptin and transforming growth factor β (TGF-β) levels. Methods Serum leptin and TGF-β in 24 patients with osteoporosis were measured by ELISA, and compared with that in 24 healthy subjects as control. Results The serum TGF-β in the patients with osteoporosis was significantly lower than that in healthy subjects.however,there was no significant difference in serum leptin between patients and healthy subjects.The serum TGF-β was positively correlated with bone mineral density.However,there is not correlation between serum leptin and bone mineral density. Conclusion The decreased level of TGF-β may be one of the causes to precipitate osteoporosis, but there is no direct evidence demonstrating the change of serum leptin is correlated with the pathogonesis of osteoporosis.

　　Keywords: Osteoporosis;Leptin;Transforming growth factor β;ELISA

　　骨质疏松症是一种以全身骨量减少，骨微细结构退化为特征，骨密度降低，致使骨的脆性增加而易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病,尤以绝经后妇女为甚。成骨能力下降被认为是骨质疏松症的主要发病机制。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)和瘦素(leptin)对成骨有重要调节作用。本研究通过检测骨质疏松症患者血清瘦素和TGF-β水平，以探求二者与骨质疏松症发病是否存在相关性，进一步阐明这两种细胞因子在骨质疏松症发病中的作用。

　　1　　材料与方法

　　1.1　　标本采集按照中国人骨质疏松症的建议诊断标准(第二稿)[1]，随机选取骨质疏松症病人24例为骨质疏松组，其中男性6例，女性18例，最大年龄63岁，最小年龄42岁，平均年龄(54.08±5.91)岁。另选24例做对照组，均临床排除骨质疏松症，其中男性9例，女性15例，最大年龄59岁，最小年龄44岁，平均年龄(52.08±4.96)岁。以上对象均排除慢性肝、肾、胃肠疾病和各种内分泌疾病，免疫系统疾病，白血病，骨髓瘤，淋巴瘤，以及过度嗜烟或过度饮酒者。抽取检测对象的静脉血2 ml，4 000转/分，离心10 min，分离血清，标本放置超低温冰箱(-80 ℃)保存，避免反复冻融，待标本收集齐后统一测试。

　　1.2　　实验仪器与试剂双能X线骨密度仪为美国Hologic 2000 plus型;连续波长酶标仪为美国ELX 800型;人TGF- β夹心法ELISA检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司;人瘦素夹心法ELISA检测试剂盒购自天津九鼎医学生物有限公司。

　　1.3　　血清TGF-β和瘦素ELISA检测标准品管中加入双蒸水溶解，倍比稀释法稀释出1.6 ng/ml、3.2 ng/ml、6.3 ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml共7种浓度;将待测样品，阴性对照和倍比稀释的标准品分别加入相应孔中，每孔100 μl，37 ℃孵育1 h;将样品吸除，洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体工作液，每孔100 μl，37 ℃孵育30 min;将抗体工作液吸除，洗板3次，每孔加入底物显色液100 μl，室温避光显色5 min，每孔加入中止液1滴;以蒸溜水清零，酶标仪读取标准品各孔492 nm吸光值(OD)，以标准品100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6和0 ng/ml浓度为横坐标，OD值为纵坐标，以平滑曲线连接各标准品的坐标点，绘出标准曲线;读取样品OD值，在标准曲线中查出相对应人血清TGF-β浓度或瘦素浓度。

　　1.4　　骨密度测定双能X线骨密度仪测腰椎椎体前后位骨密度。受试者平卧仪器床上，骨密度仪对其腰椎进行测量检查，骨矿含量等参数值由仪器计算机自动打印输出。

　　1.5　　统计学分析采用两样本均数t检验比较骨质疏松组与对照组血清瘦素与TGF-β水平。直线相关分析血清瘦素和TGF-β与骨密度之间的相关度。P<0.05为有统计学差异。统计分析软件SPSS 10.0辅助运算。

　　2　　结果

　　血清瘦素、TGF-β水平以及骨密度比较见表1,骨质疏松组平均骨密度明显低于对照组，差异具有显著性(P<0.05);血清瘦素稍高于对照组，统计学分析差异不具备显著性(P>0.05)。Pearson直线相关分析显示：血清TGF-β水平与骨密度之间呈正相关(r=0.34，P<0.05)，血清瘦素水平与骨密度之间不存在相关性(r=0.24，P>0.05)。而血清瘦素与TGF-β水平之间也不存在相关性(r=0.21，P>0.05)。

　　表1　　两组血清瘦素、TGF-β水平以及骨密度比较(略)

　　注：与对照组比较，*P<0.05

　　3　　讨论

　　骨质疏松症以全身骨量减少,骨的微细结构退化为特征，正常骨代谢周期中，骨吸收和骨形成维持在一种动态平衡状态。破骨细胞的骨吸收活动和成骨细胞的骨形成活动相互偶联，不断进行着骨重建。一旦偶联被打破，平衡失衡，破骨细胞的骨吸收活动相对增强或成骨细胞的骨形成活动相对减弱，骨吸收大于骨形成发生骨质丢失，将导致骨质疏松。近年来，随着免疫学的不断发展，细胞因子在骨质疏松症发病中的作用越来越受到重视。骨质疏松症发病有多种细胞因子参与，包括雌激素、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、TGF-β和瘦素等。TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽，在体内广泛分布，能刺激细胞表型发生转化，调节细胞的生长与分化。TGF-β是骨中含量最多的一种生长因子。一方面成骨细胞本身可合成分泌TGF-β;另一方面在成骨细胞的细胞膜上有TGF-β的特异性受体。TGF-β对成骨细胞和破骨细胞均有调节作用。对于成骨细胞，TGF-β可促进其的增殖和分化，促进细胞外基质合成的作用[2]。此外，TGF-β还作用于成骨细胞的前体：骨髓成骨细胞祖细胞。当体内TGF-β含量减少或加入TGF-β抗体后，骨髓中成骨细胞祖细胞增殖能力减弱，导致成骨细胞数量减少和活性下降。对于破骨细胞的增殖和功能，TGF-β也有明显的促进作用。在体外培养的破骨细胞培养液中加入TGF-β后，破骨样细胞数目及骨吸收面积显著增加。对破骨细胞的促进作用，可能是炎症状态下发生过度吸收的机制之一[3]。瘦素于1994年被发现[4]，最初被认为是具有中枢调节和外周局部作用的细胞因子。近来研究表明，瘦素还参与体内包括骨组织在内的多种组织代谢调节。有趣的是，在外周与在下丘脑中枢，瘦素对成骨的作用完全不同。在外周，瘦素具有明显的促进成骨作用。向进入矿化期的原代培养正常人成骨细胞或骨肉瘤细胞培养液中加入瘦素，可显著增加骨细胞的矿化结节[5]。瘦素还可促进骨髓成骨祖细胞向成骨细胞转化，并抑制向脂肪细胞分化的能力[6]。 此外，瘦素对血管内皮细胞的增殖、迁移、小管形成和基质金属酶2的活性都有一定程度的促进作用，提示瘦素可能通过调节血管新生而影响软骨的骨化[7]。然而在中枢下丘脑，瘦素对骨代谢的影响却完全不同，呈抑制成骨作用。饥饿及体重减轻时，瘦素水平降低，同时成骨细胞活性也降低[8]。接受脑室内瘦素注射的小鼠，其骨量发生下降[9]。瘦素缺乏小鼠，以及使用瘦素拮抗剂，可使小鼠血清骨钙素升高。TGF-β与瘦素表达都与体内雌激素有一定联系。TGF-β与雌激素水平关系密切。去卵巢大鼠血清TGF-β浓度随血清雌二醇浓度水平的下降而降低[10]。在男性中，雌激素水平降低也与TGF-β下降呈正相关[11]。在生理浓度下，TGF-β还能提高细胞表面雌激素受体基因表达水平和靶细胞对雌激素的敏感性[12]。瘦素主要受胰岛素和IGF-1的调节。雌激素对瘦素水平也有一定的促进作用。女性瘦素水平高于男性。TGF-β与瘦素本身也相互影响作用。通过Ob受体，瘦素与TGF-β对肠血管肽的表达具有协同促进作用[12]。在肾小球内皮细胞和腹膜间质细胞中，瘦素都可以诱导TGF-β表达[13-14]。本研究发现，骨质疏松症患者血清TGF-β显著降低，且TGF-β水平与骨密度呈正相关，提示TGF-β水平下降可能是影响骨质疏松症发病的因素之一。该结果预示着，TGF-β检测有可能成为骨质疏松症的诊断指标，有助于判断骨质疏松症的预后，以及作为治疗疗效的判断标准，另一方面，通过静脉等途径补充TGF-β蛋白，有可能有效改善骨质疏松症病情，改善患者生活质量和预后。而本研究的另一项观测指标血清瘦素水平，则与骨质疏松无明显相关性。骨质疏松症患者瘦素水平与正常人无显著差异。瘦素在下丘脑中抑制成骨的作用可能抵消了其在外周促进成骨的作用。推测说明，直接补充血清瘦素，对骨质疏松症的防治疗效可能有限。不过通过基因治疗等手段，提高骨组织中的瘦素表达量，改善骨质疏松症在理论上仍然可行。在本研究中，骨质疏松症患者血清瘦素与血清TGF-β水平并没有明显的相关性。我们考虑并非二者之间在骨质疏松症发病中不存在联系，而是由于骨质疏松症发病机制复杂，影响因素较多。我们计划在今后进一步研究中进行动物实验，对骨质疏松模型动物分别或联合进行TGF-β和瘦素干预，以进一步揭示细胞因子在骨质疏松症的发病以及防治中的作用。

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　　(武汉大学医学院人体解剖与组织胚胎学系，湖北 武汉　　430071;郧阳医学院附属人民医院创伤骨科，附属太和医院骨科，湖北 十堰　442000)