脑红蛋白的神经细胞保护机制研究概况

　　作者：黄瑞勇　　作者单位：广西平果县人民医院检验科，广西平果 531400

　　【关键词】 脑红蛋白;缺血缺氧;神经保护

　　氧是机体新陈代谢和维持生存的必要因素，人们很早就知道血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)是机体氧的转运与储存、线粒体耗氧产能及清除多余氧等过程中的关键物质。而对高耗氧的脑组织，人们一直都未能发现能够促进神经系统氧利用的关键分子。脑红蛋白(Ngb)是德国科学家Burmester T等[1]在2000年首次发现的存在于人和小鼠脑组织内，功能上类似于肌红蛋白的携氧球蛋白。含量虽低，仅占脑组织蛋白的0.01%左右[1]，但与脑的氧供应密切相关，在分子水平上调节脑组织氧的供应状态，近年来逐渐成了神经科学研究的热点。国内外学者对其做了较为深入的研究，现就脑红蛋白的分子结构、在机体中的分布及功能和相关研究进展作一简要介绍。

　　一、脑红蛋白的结构

　　脑红蛋白主要以单体形式存在，由151个氨基酸组成，相对分子量为17KD，有少量脑红蛋白为多聚体，主要为二聚体，极少为四聚体，二聚体以二硫键相连。在生理状态下Ngb以还原状态即脱氧形式(F8His2+-E7His)存在，其结构为6配体，人和小鼠 Ngb是球蛋白当中第一个具有6个配体的单体蛋白[2]。Ngb与Hb、Mb均为含铁卟啉的蛋白，但在基因组成和蛋白结构等方面与Hb、Mb有较大差异。Ngb基因在高级脊椎动物中是一种高度保守的基因，序列同源性分析表明，大鼠和小鼠Ngb基因序列同源性为96%，与人类Ngb同源性为88%，但与脊椎动物其他球蛋白则有很低的同源性，与Mb序列一致性<21%，与Hb一致性<25%。国内张成岗等[3]用RTPCR法首先克隆了Ngb基因，人Ngb基因约长8041bp，放射原位标记发现人Ngb位于14q24染色体上。Ngb具有独特的外显子和内含子结构，有4个外显子和3个内含子，其中3个内含子分别位于B122、E110、和G70，与 Hb、Mb比较，E110为其独特的内含子，该基因的启动子区域含有几个潜在的转录因子SP1的结合位点。同时Ngb还具有经典螺旋三折叠结构特性[4]，基本结构是一个血红素结构和蛋白质肽链。

　　二、脑红蛋白的分布

　　脑红蛋白广泛存在于动物器官组织中。在哺乳动物中，目前已经在小鼠、大鼠和人中发现了Ngb，Burmester等[1]用Northern杂交和原位杂交技术证实脑红蛋白在小鼠和人脑组织中脑前叶、下丘脑和丘脑等处表达最强。邓美玉等[5～6]用原位杂交及免疫组化技术分析发现，Ngb mRNA阳性细胞广泛存在于大鼠脑内各个区域，定位于神经元细胞质内。Ngb免疫反应物质在脑中不同区域表达水平不同，大脑皮质表达水平较高，海马区、丘脑、下丘脑均有散在分布。小脑中阳性细胞较强，主要分布于浦肯野细胞。在脑干、脑桥中也观察到阳性细胞分布，但较少。Schmidt等[7]还观察到Ngb在小鼠的视网膜中大量表达，其密度大概是大脑中的100倍，主要分布在视网膜中耗氧最多的视细胞外网层、内网层及节细胞层中，提示Ngb参与了高耗氧的视觉感受和视觉形成过程。王航雁等[8]研究发现，人体不同组织中除脑组织中表达相对较高外，在多种组织中都有表达，胎肾、人肝等组织Ngb mRNA表达甚至大于大脑皮质、全脑和小脑，说明Ngb基因并不是神经系统特异性的，可能在机体许多组织、脏器中广泛区域发挥作用，这很可能与多种组织氧利用有密切关系。此外，内分泌系统如垂体、胰岛的Langerhans细胞、肾上腺中也有表达。

　　三、脑红蛋白的生物学功能

　　脑红蛋白的生物学功能目前尚不完全清楚，可能与下面几方面有关：①在氧代谢方面有类似Mb的功能。储存氧气和促进氧气向线粒体扩散或直接介导氧气向线粒体的传递，促进ATP的产生，从而维持正常神经元的功能。Ngb 能够可逆性地结合氧，与氧气有很高的亲和力，半饱和压力(P50)约为2托(torr),高于哺乳动物Hb(约为26托)，低于Mb(约为1托)，该特性使得即使血氧浓度较低，也十分有利于转运氧气通过血脑屏障，提高高耗氧的脑组织中氧的利用率。实验表明Ngb在缺血缺氧状态下表达增加，且高度表达的Ngb能够使培养的神经元在缺氧情况下存活率升高和急性缺血状态下大鼠脑梗死体积缩小[9]，提示Ngb在脑缺血缺氧性损伤中对神经元有保护作用。目前缺氧诱导Ngb表达上调的机制仍未阐明，可能与缺氧诱导转录因子HIF1有关[10]。②氧气感受功能。结合配体时6配位珠蛋白血红素袋的构象变化较大，提示Ngb可能作为氧气感受器，根据氧气浓度的变化参与细胞内信号传导通路调节[11]。③NADH氧化酶作用。在半缺氧条件下促进糖酵解，产生ATP供给能量，有助于维持神经元的正常功能。④作为活性氧和NO基团的清道夫，参与NO的代谢过程，从而减轻其对神经系统的损伤。

　　四、脑红蛋白与缺血缺氧性疾病

　　目前较多研究表明Ngb对脑缺血缺氧有保护作用，这方面研究可以分为两大类，一类是在缺血缺氧条件下观察到在体或离体神经细胞脑红蛋白的表达升高，因此推测它起到脑保护作用。另一类是在缺血缺氧条件下人为增强或降低脑红蛋白的表达，观察到在体或离体神经细胞损伤减轻或增加，这类实验被认为具有较强的说服力。Sun等[9]通过向大鼠脑室注入脱氧核苷酸，中动脉闭塞后脑梗死面积增加，再给予表达Ngb的腺病毒载体后与对照组比较梗死灶体积减少50%，而利用反义寡核苷酸技术减少其Ngb的表达时，脑梗死体积较对照组增加了60%。另外，用NgbTAT治疗培养的大鼠皮质神经元细胞可以降低细胞对氧的敏感性[12]，说明其可能在氧化应激诱导细胞损伤中起保护作用。过分表达Ngb的转基因小鼠实验也发现可以降低脑梗死体积[13]。还有实验将小鼠大脑中动脉结扎90 min后再灌注4～24 h,发现神经元胞质内Ngb的表达量也增加。以上实验表明Ngb在缺血缺氧情况下对脑组织具有保护作用。张成岗[14]等采用RTPCR技术对大鼠缺血缺氧损伤时脑组织中 Ngb mRNA水平的变化进行动态研究,发现该基因表达显著升高，并呈时相变化，双侧总动脉夹闭1 min后脑组织中Ngb mRNA迅速增至高峰，5 min时仍然保持高水平，15 min时迅速降低，此后又缓慢升高，提示Ngb可能在脑缺氧适应性调节中起到重要作用。以往Ngb的研究主要集中在模型和动物实验方面，在临床应用研究方面目前还处于探索阶段。最近国内王航雁等[15～16]用ELISA方法检测新生儿血清Ngb，观察新生儿和早产儿动脉血清中Ngb表达的变化，并探讨其临床意义，发现Ngb表达无性别差异，并初步确定了足月健康新生儿血清Ngb的参考范围。研究还发现宫内窘迫新生儿血清Ngb表达水平显著高于健康对照组，认为新生儿脐动脉血清 Ngb水平作为HIE的早期检测指标具有临床应用价值，该实验为Ngb在临床应用方面的研究提供了新的思路。Ngb在成人神经系统性疾病的临床应用研究尚未见报道。

　　五、脑红蛋白与创伤性脑损伤

　　目前多个研究显示在脑缺血缺氧时Ngb的表达升高，表明了Ngb对缺血缺氧性脑损伤有保护作用，是否对创伤性脑损伤也有保护作用呢?近年来也有学者在这方面做了一些研究。国内周定标等[17]通过体外培养原代神经元损伤模型的建立，采用免疫组化和图像分析技术观测损伤前、后不同时间点神经元Ngb免疫组化反应物和阳性信号值，结果发现，12 h后Ngb阳性信号开始增加，16 h达到高峰，随后逐渐下降，128 h后恢复正常水平，表明机械损伤可以诱导神经元Ngb在一定时间段内表达上调，Ngb可能参与了机械损伤后神经元的修复过程。研究还表明，大鼠弥漫性颅脑损伤后Ngb mRNA的表达呈双峰型，提示其可能参与神经元损伤后应激及继发性脑缺血缺氧性脑损伤的应答机制[18]。同样，大鼠脑外伤后在伤灶周围皮质神经元内也观察到Ngb表达明显升高[19]。以上研究表明，Ngb可能参与了脑外伤后神经元的保护作用。众所周知，继发性脑损伤的实质是脑组织的缺血缺氧，尸检发现，脑外伤死亡的病人90%都存在脑缺血，改善脑外伤病人预后的关键在于抑制原发性脑损伤后的继发性脑缺血缺氧损伤，脑红蛋白的发现，为继发性脑损伤的研究与防治提供了新的思路。

　　六、脑红蛋白与其他疾病

　　作为一种新发现的携氧球蛋白，因为脑红蛋白的特殊分子结构和其对氧有很高的亲和力，以及Ngb的神经元定位和可能的内源性神经保护因子的功能，为神经系统氧的利用及神经元保护等方面的研究提供了一条新的途径，目前成为神经内科、神经外科以及机体组织氧利用方面研究的热点，并取得了一定的成果。对其他疾病也具有保护的作用，有研究认为，脑红蛋白在视网膜、生殖系统中的高浓度表达，为视神经缺氧性病变如高原眼底病、男性不育的治疗方面指出了新的方向，具有重要的临床意义[20]。近来研究还发现脑红蛋白在神经系统退行性变中具有保护作用，与某些老年神经系统疾病的发生和发展有着某种联系[21]，这些发现为帕金森氏综合征、阿尔茨海默病等的治疗带来了新的希望。Fordel等[22]研究发现Ngb还可以保护细胞免受非缺氧性损伤，提示它可能还有更为广泛的内源性作用。虽然Ngb已成为目前神经科学研究的热点，并在基因序列、定位、蛋白结构等方面进行了较为深入的研究，但当前仍然存在几个问题：①Ngb的生理功能目前还存在争议;②Ngb到底是通过何种方式、如何对神经元实施保护;③Ngb受缺氧诱导所涉及的信号传导途径仍然不明了;④Ngb的相关临床应用研究少见有报道。

　　综上所述，Ngb是一种新的内源性神经保护因子，在神经系统疾病及组织氧利用等方面的研究具有重要的应用价值，对于Ngb保护神经细胞机制的研究及在临床上如何加以利用是未来Ngb研究方向。

　　【参考文献】

　　[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407:520-523.

　　[2]Tren JT 3rd,Watts RA Hargrove Ms.Human neuroglobin,ahexacoordinate hemoglobin that revevsiby binds oxygen[J].Biol chen,2001,276:30106-30110.

　　[3]Zhang C, Wang C, Deng M,et al. Full-length Cdna cloning of human neuroglobin and tissue expression of rat neuroglobin[J].Biochem Biophys Res commun.2002,290:1411-1419.

　　[4]Pesce A, Dewilde S,Nardini M,et al.Human brain neuroglobin structure reveals a distinct mode of controlling oxygen affinity[J].structur,2003,11(9):1087-1095.

　　[5]邓美玉，张成岗，王航雁，等.脑红蛋白mRNA在大鼠脑内的定位[J].解剖学报，2003，34(1)：85-89.

　　[6]邓美玉，张成岗，李 林，等.用免疫组化方法检测脑红蛋白在大鼠中枢神经系统的分布[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2003，11(3)：271-274.

　　[7]Schmidt M,Giessl A,Laufs T,et al.How does the eye breathe?Evidence for the neuroglobin-mediated oxygen supply in the manmalin retina[J].J Biol Chem,2003,278(3)：1932-1935.

　　[8]王航雁，邓美玉，王 静，等.脑红蛋白基因在人体不同组织中的表达[J].实用儿科临床杂志，2004，19(4)：278-280.

　　[9]Sun Y,Jin K,Peel A,et al.Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(6)：3497-3500.

　　[10]Sun Y,Jin K,Nao XO,et al.Neuroglobin is up-reglulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(26)：15306-15311.

　　[11]Kriegl JM,Bhattacharyya AJ,Nienhaus K,et al.Ligand binding and protein dynamics in neuroglobin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(12)：7992-7997.

　　[12]Zhou G Y,Zhou S N,Loi Z Y,et al.Translocation and neuroprotective properties of transactivator-of-transcription protein-transduction domain-neuroglobin fusion protein in primary cultured cortical neurons[J].Biotehonl Appl Biochen,2008,49(Pt1)：25-33.

　　[13]Khan AA,Wang Y,Sunn Y,et al.Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia[J].Proc Natl Acad Sic USA,2006,103(47)：17944-17948.

　　[14]邓美玉，张成岗，王春丽，等.大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织中脑红蛋白基因表达的变化[J].中华病理学杂志，2002，31：261-262.

　　[15]王航雁，王 静，王 萍，等.脑红蛋白在新生儿血清的表达及临床意义[J].中华围产医学杂志，2007，10(2)：121-122.

　　[16]王 静，王航雁，王 萍，等.宫内窘迫新生儿血清脑红蛋白的变化[J].实用儿科临床杂志，2009，24(2)：104-105.

　　[17]刘开东，周定标，尚爱加，等.体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后脑红蛋白的表达[J].中国微侵袭神经外科杂志，2008，13(2)：68-70.

　　[18]林 欣，周定标，尚爱加，等.大鼠弥漫性颅脑损伤后脑红蛋白mRNA变化的实验研究[J].中国微侵袭神经外科杂志，2007，12(5)：221-224.

　　[19]冯兴军，周定标，尚爱加，等.大鼠脑外伤后伤灶周围皮质脑红蛋白的表达变化[J].解放军医学杂志，2008，33(5)：543-545.

　　[20]秦豪杰，武 娜，张录顺，等.脑红蛋白在成年男性生殖系统的表达意义[J].解剖学杂志，2008，31(3)：348-350.

　　[21]Sun Y,Jin K,Mao X O,et al.Effect of aging on neuroglobin expression in rodent brain[J].Neurobiol Aging,2005,26(2)：275-278.

　　[22]Fordel E,Thijs L,Martinet W,et al.Dewilde,Neuroglobin and cytogloin overexpression protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death[J].Neurosci Lett,2006,410(2)：146-151.