多系统萎缩患者TCR α链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解

　　作者：田丹,孙永萍,汤贤英,马锐　　作者单位：1.遵义医学院 免疫学教研室， 贵州 遵义 563003

　　【摘要】目的： 利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测1例多系统萎缩患者TCR α链CDR3谱系。方法： 提取1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)中的总RNA，逆转录成cDNA，以32个人TCR α 链胚系可变区基因家族 (TRAV)设计上游引物，共同的TCR α链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物，荧光定量PCR(FQPCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系，溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单、寡、多克隆增生，挑选单克隆进行PCR扩增，扩增产物行普通琼脂糖凝胶回收后测序分析。结果： 多系统萎缩患者和正常人PBMC的32个TCR α 链TRAV家族CDR3谱型的FQPCR产物的各家族相对定量表达不一;正常人的32个TCR α 链TRAV家族CDR3谱型的溶解曲线图表现为多个峰型的高斯分布，多系统萎缩患者的TRAV10、TRAV15、TRAV29家族CDR3谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生，其他家族为多峰、寡峰的多克隆及寡克隆增生，未出现缺失的家族，对单峰的TRAV15家族的测序得到的CDR3区的氨基酸组成为：SAIYFCAEDRDSTLTFG。结论： 该多系统萎缩患者的PMBC中，存在TCR α链CDR3谱系漂移。

　　【关键词】 多系统萎缩,互补决定区,荧光定量PCR,溶解曲线

　　[Abstract] Objective: To analyze CDR3 spectratype of TCR alpha gene in peripheral blood monouclear cells (PBMC) of one patient with multiple system atrophy (MSA) by using DNA melting curve technique with realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Methods: Total RNA from PBMC of a healthy donor and a MSA patient were transcripted reversely into cDNA respectively.The forward primers were designed according to the 32 human TRAV gene families, and the reverse primers designed according to TRAC. FQPCR was carried out to amplify CDR3 spectratyping of the 32 human TRAV gene families (HTGF), and the monoclonal/oligoclonal/polyclonal CDR3 were analyzed with DNA melting curves. Monoclonal T cells of TRAV families were amplified and sequenced. Results: The FQPCR products of HTGF of the MSA patient were different from those of normal people. The 32 HTGF melting curves of normal people showed Gaussian distribution with several peaks, while those of the MSA patient showed monopeak cloning increase in TRAV10, TRAV15, and TRAV29 gene families, and multipeak/oligpeakmultclone/oligclone increase in other gene families. No deletion family was found. The CDR3 amino acid sequence of TRAV15 which showed monopeak was inferred as SAIYFCAEDRDSTLTFG according to the DNA sequence obtained. Conclusion: There might be spectratyping drift in CDR3 on TCR alpha chain in PBMC of MSA patient.

　　[Key words] multiple system atrophy;complementarity determining regions; realtime fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; melting curve

　　多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)是一组原因未明成年起病的神经系统多个部位相继进行性萎缩的疾病或综合征。由于该病患病率较低，症状与帕金森综合征、震颤麻痹症等神经病症相似，早期明确诊断比较困难，目前也尚无特异性的治疗方法，临床以对症治疗为主，患者预后较差[1，2]。目前，多系统萎缩的相关研究主要集中在分子生物学及蛋白质病理学领域，而在免疫学方面少见研究报道[3]。近年来，TCR CDR3谱型的免疫指纹技术在病毒感染、肿瘤、自身免疫病的研究中得到了较为广泛的应用,但受到较多关注的是T细胞TCR β链CDR3谱系的研究，而TCR α链谱系研究报道较少[4]。前期研究中已建立起检测TCR α、β链CDR3谱系漂移的“免疫扫描谱型分析技术”和“荧光定量溶解曲线分析技术”，并对1例MSA患者外周血TCR β链CDR3谱系进行了初步的探讨[5～8]。现拟通过对该例患者TCR α 链 32 个家族的CDR3谱系进行分析，初步探讨TCR α 链CDR3谱系的变化及这种变化在MSA疾病过程中的可能意义，为进一步增加病例样本的研究提供基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究样本及细胞株

　　1例多系统萎缩患者，按多系统萎缩临床诊断标准确诊[8]。患者外周血，来源于遵义医学院第一附属医院;对照样本为正常志愿者外周血。对照子宫颈癌细胞株(JEC)，由遵义医学院微生物学教研室提供。

　　1.2 试剂

　　总RNA提取试剂盒(TIANGEN)、cDNA 合成kit(MBI,Fermentas)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)等。

　　1.3 引物设计与合成

　　参照文献[5～7]，合成人TCR AV32基因家族上游引物34条(TRAV1和TRAV4分别有2个亚家族)，共同的TCR AC下游引物1条，对照的GAPDH上、下游引物，由invitrogen 上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.4 总RNA提取和cDNA合成

　　分别采集多系统萎缩患者和正常人外周血5 ml,按密度梯度离心法分离PBMC, 按总RNA提取试剂盒操作，提取JEC细胞、1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)(2×106细胞)中的总RNA，按cDNA kit条件，用Oligo dT引物逆转录制备cDNA。

　　1.5 TRAV家族CDR3区段cDNA的FQPCR扩增

　　反应体系：每例样本做36个PCR反应管，第1～34管分别加入TRAV1至TRAV32上游引物1 μl(各引物浓度均为10 mmol/L,TRAV1和 TRAV4分别为2个亚家族)，1～34管每管加入TRAC下游引物1 μl，第35管加GAPDH上、下游引物，第36管为无引物的阴性对照管;每个PCR反应管分别加样品1 μl、荧光定量Mix 10 μl、纯水7 μl，总体积20 μl;标准曲线选取JEC细胞株的GAPDH表达量为相对量标准进行PCR。

　　反应条件：(1)94 ℃ 3 min，1 cycles; 94 ℃ 30 sec，55 ℃30 sec，72 ℃50 sec，45 cycles;72 ℃ 10 min，1 cycles;(2)溶解曲线分析：75～95 ℃以0.2 ℃/s读取荧光值，100 cycles;(3)溶解曲线分析后的PCR产物按上述反应条件(1)的步骤将45 cycles 改成5 cycles进行PCR，取8 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶内进行电泳，余-20 ℃保存备用。

　　1.6 PCR产物序列分析

　　反应体系：TRAV15的FQPCR产物2 μl，加入TRAV15上游引物2 μl(引物浓度均为10 mmol/L)，加入TRAC下游引物2 μl，Taq DNA Polymerase 0.25 μl，2 mmol/L dNTP 5 μl，10倍Buffer with KCL，MgCl2 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl， DDW 30.75 μl，总体积50 μl。

　　反应条件：95 ℃ 2 min，1 cycles;95 ℃ 30 sec， 60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 cycles;72 ℃ 10 min，1 cycles。

　　2 结果

　　2.1 正常人PBMC的32个TCR α链TRAV家族CDR3谱型的FQPCR产物溶解曲线峰图均为多克隆的高斯分布(图1)。患者PBMC的32个TCR α链TRAV家族CDR3谱型的FQPCR产物的各家族溶解曲线峰图中的TRAV10、TRAV15、TRAV29家族表现为单克隆增生峰图，其他家族为多克隆和寡克隆增生峰图，未出现缺失的家族(图2)。

　　2.2 对患者所出现的TRAV 15寡克隆性的PCR产物进行测序, CDR3区的基因序列： TCA GCT ATC TAC TTC TGT GCA GAG GAT AGA GAC AGC ACC CTC ACC TTT GGG ACA GGG GAC TAT(图3); 翻译后相应的CDR3区氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLTFG(表1)。

　　3 讨论

　　MSA自1969年首次命名以来，至今病因不明，目前涉及的有脂质过氧化损伤、酶代谢异常、慢性病毒感染、神经元凋亡、少突胶质细胞胞质内包注：呈现单峰的家族为：TRAV10、TRAV15、 TRAV29;对照涵体等导致的进行性神经系统多系统变性[1～3]。在免疫学方面的研究，Hiroyuki[9]等认为白介素lα、白介素8、细胞黏附因子l及肿瘤坏死因子与MSA的发病有相关性。

　　随着TCR在获得性免疫应答中的不断深入研究，目前发现每个T细胞有着自己独特的TCR CDR3分子，不同T细胞克隆具有不同序列的CDR3基因组成(不同长度)，从而形成多样性的CDR3基因谱型，CDR3区的序列决定其结构，从而决定TCR的特异性，或者说，CDR3相当于T细胞的“指纹”，监测CDR3序列的多态性和长度分布以及不同病理状态下的频率变化(谱系漂移)，可以反映特定T细胞克隆扩增的程度，从而反映T细胞功能状态。本研究组目前已建立了监测人TCR α链和β链CDR3谱系免疫扫描谱型分析技术和荧光定量溶解曲线分析技术,对多例白血病、图3 患者TRAV 15家族CDR3区测序结果表1 患者TCR AV 15家族CDR3区测序结果翻译后的氨基酸序列大肠癌等患者进行了TCR CDR3基因谱系分析 [5～7]。

　　本实验以MSA患者PBMC为研究对象，采用荧光定量溶解曲线分析技术分析，患者PBMC的32个TCR α 链TCR AV家族CDR3谱型的FQPCR产物的各家族相对定量表达不一，其中TRAV10、TRAV15、TRAV29家族表现为单克隆增生，其他家族为多克隆和寡克隆，未出现缺失的家族，正常人的TCR α 链 CDR3谱型荧光定量PCR溶解曲线为高斯分布[6]。对单克隆增生的TRAV15家族的测序得到的CDR3区的基因序列：TCA GCT ATC TAC TTC TGT GCA GAG GAT AGA GAC AGC ACC CTC ACC TTT GGG; 翻译后相应的CDR3区氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLTFG。TRAV10和TRAV29 2个单克隆增生家族的PCR产物未直接测出序，可能和PCR纯度和寡克隆干扰相关。以上结果提示该MSA患者TCR α链CDR3可能存在谱系漂移。

　　由于这种病例较为少见，本研究仅获得1例MSA患者TCR α链CDR3谱系研究资料，进一步研究将扩大样本量, 探讨漂移家族T淋巴细胞的CDR3特异性在多系统萎缩发病机制中的作用，为该疾病寻找新的辅助诊断指标及指导临床对患者的个性化治疗提供依据

　　【参考文献】

　　[1]王博，张朝东，李昭,等.多系统萎缩的临床特征与疾病进展的特点[J].临床神经病学杂志，2007(6)：407-410.

　　[2]赵景礼.多系统萎缩的回顾与进展[J].临床神经病学杂志，2000(6)：377-378.

　　[3]庄柏翔.多系统萎缩基础及临床研究[J].中国医师进修杂志,2006(8);10-12.

　　[4]姚新生.TCRβ链CDR3谱序与疾病研究概况及进展[J].国际免疫学杂志，2007(4)：240-243.

　　[5]姚新生，马骊，温茜,等.监测TCR CDR3 漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定[J].中华微生物和免疫学杂志，2006(6)：571-573.

　　[6]汤贤英，孙永苹，马锐,等.“荧光定量PCR溶解曲线法”监测人TCR α链CDR3谱系漂移技术的建立[J].中国免疫学杂志，2009(8):727-730.

　　[7]马锐,罗荣,孙万邦,等.荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR β链CDR3谱系漂移技术的建立[J]. 免疫学杂志,2009(4):446-451.

　　[8]马锐，周建伟，胡雅丽,等.荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测多系统萎缩患者TCR β链CDR3谱序初探[J].遵义医学院学报，2009(1)：1-4.

　　[9]Hiroyuki S，Ichim Y，Asako T，et a1.Heredity in multiple system atrophy[J].J Neurological Sciences，2006(240)：107-110.