杜仲对去势大鼠腰椎骨和rBMSCs TGFβ与FGF2表达调控

　　作者：冯展波1， 赵 春2， 谢焕松1， 夏树林1， 张艳红2， 谭湘陵2 作者单位：(1南通大学生命科学学院，南通 220007， 2南通大学生物工程研究所)

　　【摘要】 目的：观察杜仲干预去势大鼠腰椎骨及对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells, rBMSCs)转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)和成纤维生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)表达的调控。方法： (1)80只4月龄雌性SD大鼠随机分成4组，假手术组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。除假手术组打开腹腔、暴露卵巢后即缝合外，其他3组均摘除双侧卵巢。大鼠手术10天后，阳性对照组和实验组分别用阿尔法骨化醇(ALF)和盐杜仲灌胃，每天一次，另外2组正常饲养。灌胃3个月后，解剖取各组第一腰椎骨，4%多聚甲醛固定，3天后浸入4% EDTA溶液中脱钙，4周后冰冻切片，免疫组化检测各组中TGFβ与FGF2表达;(2)取盐杜仲粉末2 g，分别加水或甲醇至15 ml，室温震荡1 h，静置过夜后，离心弃沉淀。水浸上清不经进一步处理即得水提取物;甲醇浸上清经真空浓缩，再加水至15 ml溶解剩余物后，得醇提取物。水/醇提取物均经0.22 μm膜过滤，-20℃保存;(3)取2月龄SD大鼠骨髓细胞，置含20%小牛血清的DMEM/F12培养基中，37℃，5% CO2培养，传代3次后进行杜仲水/醇提取物诱导，诱导物分为10-2、10-3、10-4和10-5 4个稀释度并设4个重复组，同时设一不加诱导物的对照细胞培养组。诱导6天后，免疫细胞化学法测定BMP-2表达。结果： 与假手术组比较，阴性对照组腰椎骨中TGFβ、FGF2表达均下降;与阴性对照组相比，ALF阳性对照组和杜仲实验组TGFβ和FGF2表达上升;与对照细胞培养组比较，杜仲水/醇提取物诱导rBMSCs FGF2的表达显著升高，但TGFβ的表达变化不显著。 结论： 杜仲改善去势大鼠骨质疏松状态与调节TGFβ、FGF2表达相关，杜仲具有直接刺激细胞FGF2的表达的作用。

　　【关键词】 转化生长因子β;成纤维生长因子2;杜仲;去势大鼠;大鼠骨髓间充质干细胞

　　Expression of TGFβ and FGF2 in lumber vertebrae after treatment with

　　Eucommia Bark to ovariectomized rat and to rBMSCs

　　FENG Zhanbo1, ZHAO Chun2, XIE Huansong1， et al (1Life School of Nantong University, Nantong 226007， 2Institute of Bioengineering of Nantong University)

　　[Abstract] Objective： To examine the expression of transforming growth factor β (TGFβ) and fibroblast growth factor 2 (FGF2) in lumber vertebrae after treatment with Eucommia Bark to ovariectomized (ovx) rat and to rat bone mesenchymal stem cells (rBMSCs). Methods: 80 female SD rats were divided into 4 groups, sham, negative, positive and experimental groups. All rats were subjected to ovariectomy except sham group. 10 days post surgery, intragastric administration was used to rats in positive and experimental group with Alfacalcidol (ALF) and Eucommia Bark once a day respectively. Other groups were breeded normally. After 3 months, lumber vertebrae was separated and fixed in 4% paraformaldehyde for 3 days, and then the decalcification was performed in 4% EDTA for 4 weeks. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of TGFβ and FGF2 on frozen sections. Water or methanol added to 2 g of powder of eucommia bark to 15 ml, and shaked for 1 h at room temperature. After soaked overnight, both extracts were centrifuged at 15000 rpm for 10 min. Water extract was obtained without other treatment from supernatant in water soaked powder. In MeOH soaked powder, MeOH extract was obtained by concentrated supernatant in vacuo and resolved using 15 ml water. Water and MeOH extract were then filtered by membrane of 0.22 μm, and conserved at -20℃. Bone marrow cells were obtained from SD rat of 2 months, and cultured in DMEM/F12 (1∶1) medium containing 20% FBS at 37℃, 5% CO2 condition. Induction of osteogenic differentiation was performed after passage 3. For induction experiments, both water and MeOH extract were diluted to 10-2, 10-3, 10-4 and 10-5 respectively, and 4 repeated groups were set for every dilution, and a control group of cell culture did not plus any inducer was set . At 6 days with induction, expression of TGFβ and FGF2 was detected by the method of immunocytochemistry. Results: In negative group, the expression of TGFβ and FGF2 decreased obviously compared to sham group, and increased in positive and experimental groups compared to negative group. Both water and 骨质疏松症(osteoporosis，OP)是指以全身骨量减少，骨的微细结构退化为特征，致使骨的脆性增加而易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，因发病率高，治疗难度大而受到学术界高度重视[1]。OP的发病机理极其复杂，虽然近年来的研究，特别是在遗传因素和分子、细胞机制等方面取得了一定的进展，但仍有许多的问题还未得到明确的解释。

　　杜仲(Eucommia Bark)是我国名贵滋补药材，中医学认为杜仲味甘，微辛，归肝、肾经，有补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效，国内已有部分学者探讨了杜仲对OP的干预治疗作用[2]。我们前期的研究也发现，杜仲对于去势大鼠骨质疏松具有良好的干预治疗作用。为探讨骨质疏松的分子病因和杜仲干预的分子机理，本文应用去势大鼠，检测了杜仲干预后，腰椎骨转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)和成纤维生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)的表达变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康SD雌性大鼠，4月龄，体重250～280 g，由南通大学实验动物中心提供(实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2007～0021)。

　　1.2 药物和主要试剂 阿法骨化醇(alfacalcidol，ALF)软胶囊 (江苏南通华山药业有限公司，0.25 μg/粒，生产批号：070403);盐杜仲(江苏江阴天江药业有限公司，1g/包，生产批号：070316); 兔抗大鼠-人TGFβ和FGF2一抗(北京博奥森生物技术有限公司);免疫组化试剂盒、DAB(上海太阳生物技术有限公司);FITC标记羊抗兔IgG抗体(Bioworld公司);多聚赖氨酸(Sigma公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 实验动物分组 实验大鼠随机分成4组，即假手术组、阴性对照组、阳性对照(ALF)组和实验组，每组20只。

　　1.3.2 去势动物模型制备 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，阴性对照组;阳性对照(ALF)组和实验组大鼠在无菌环境下打开腹腔，摘除卵巢，腹腔分层缝合，肌注青霉素(2万单位/只)。假手术组除不摘除卵巢外，操作均与其他组相同。

　　1.3.3 药物灌胃 大鼠手术后饲喂10天，然后开始药物灌胃。阳性对照组行ALF按照每3粒灌10只大鼠的计量，蒸馏水加热融化后灌胃;实验组行盐杜仲按照每包灌10只大鼠的计量，蒸馏水冲溶灌胃，每日一次，连续灌胃3个月。

　　1.3.4 取材及处理 大鼠颈椎脱臼处死，解剖取第1腰椎，去尽肌肉与结缔组织，截取待切片观察的组织浸入4%多聚甲醛中固定3天，然后浸入4% EDTA溶液中，室温脱钙4周，每周换液一次。

　　1.3.5 切片制备 脱钙完成后，进行冰冻切片，切片厚度10 μm，贴片于包被多聚赖氨酸的载玻片上。

　　1.3.6 切片免疫组化 将贴有切片的载玻片室温放置1 h后，-20℃丙酮固定10 min，PBS洗涤3次;3% H2O2封闭10 min;PBS冲洗2次，加山羊工作血清封闭10 min;再加TGFβ或FGF2抗体(1∶200稀释)，37℃孵育1 h，PBS冲洗;加二抗工作液(含在免疫组化试剂盒中，按说明使用)，室温10 min，PBS冲洗;DAB显色。镜检观察。

　　1.3.7 杜仲水/醇提取物制备 盐杜仲2 g，分别加蒸馏水或甲醇至15 ml，室温震荡1h，静置过夜后，15000 rpm离心10 min，弃沉淀。水浸上清即为水提取物;甲醇浸上清经真空浓缩，再加水至15 ml溶解剩余物后，得醇提取物。水/醇提取物均经0.22 μm膜过滤，-20℃保存。

　　1.3.8 rBMSCs培养 2月龄SD大鼠(雌雄不拘)颈椎脱位处死，无菌条件下取股骨和胫骨，去尽软组织后，用培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。调整细胞密度为1×105/ml后，置含20%小牛血清的DMEM/F12培养基中，在37℃，5%CO2下培养，48 h后首次换液，以后每隔2～3天换液，通过换液去掉悬浮细胞。待细胞融合至90%左右时用0.25%的胰酶消化传代。

　　1.3.9 诱导分化实验 第3代培养的骨髓基质细胞经计数接种到96孔培养板中，24 h后更换诱导培养基进行实验。实验分为3组，阳性对照组诱导物为地塞米松0.01 mmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，L-抗坏血酸钠50 μg/ml;杜仲水/醇提取物诱导组又分为10-2、10-3、10-4和10-5 4个稀释度并设4个重复;阴性对照组按照诱导物的加入量加入PBS。于诱导之后的第6天终止培养，PBS洗后用4%的多聚甲醛固定。

　　1.3.10 免疫细胞化学 固定的细胞经PBS洗后，用0.5% TritonX100作用15 min，再用PBS洗3次，加入一抗室温下孵育2 h左右，PBS洗去未结合的一抗，再加入FITC标记的二抗，在37 ℃孵育45 min后PBS冲洗，在倒置荧光显微镜下观察并拍摄。

　　2 结 果

　　2.1 腰椎骨切片TGFβ免疫组化结果 TGFβ在假手术组中表达较高，阴性对照组表达显著降低;在阳性对照组和实验组中，TGFβ表达升高，且实验组强于阳性对照组(图1)。

　　2.2 腰椎骨切片FGF2免疫组化结果 FGF2在假手术组中表达较高，阴性对照组表达显著降低;在阳性对照组和实验组中，FGF2表达升高，且实验组强于阳性对照组(图2)。

　　2.3 腰椎骨切片TGFβ和FGF2表达的细胞定位 镜检发现，TGFβ和FGF2在多种细胞中均有表达，但在成骨细胞和破骨细胞中，表达明显较其他细胞强，表达区域主要集中在胞质中(图3)。

　　2.4 rBMSCs中TGFβ与FGF2的表达 杜仲水/醇提取物对TGFβ表达的促进作用不显著(图4)，而对FGF2表达的刺激作用显著(图5)。

　　3 讨 论

　　大量的研究表明，TGFβ和FGF是调节骨代谢必须的细胞因子，在改善松质骨结构，促进成骨细胞分化和骨形成等方面具有重要作用[3-4]。研究数据表明，在骨质疏松、骨折等病变过程中，TGFβ和FGF的表达将下调[5-6]，本文的研究也证实了这一点。

　　Wei等通过实验观察到，外源性的FGF对骨质疏松大鼠具有增加松质骨量，提高骨机械强度的作用[7]。Narayana 等发现雌激素受体调节剂奥美昔芬在抑制雌激素缺乏所致的骨质疏松过程中，具有上调TGFβ表达的作用[8]，某些物理治疗方法也观察到对FGF表达产生上调作用[6]，说明骨质疏松的发生和治疗与TGFβ和FGF的表达呈现一定的相关性。

　　杜仲具有补中益精气、强筋骨、强志、安胎,有久服轻身耐老之功效，我们通过生物力学、组织学和电镜观察等研究发现，杜仲对大鼠去卵巢所致的骨质疏松具有良好的干预治疗作用(待发表)，但干预的分子机理，特别是对细胞因子的调节作用还未见报道。

　　本文观察到去卵巢大鼠TGFβ和FGF2的表达水平显著下降，经杜仲干预后TGFβ和FGF2表达明显上升，说明杜仲对TGFβ和FGF2的表达具有一定的调控作用，这种作用与骨质的改善相平行。

　　本文观察到TGFβ和FGF2在成骨细胞和破骨细胞均有表达，且变化也趋于一致。一般认为，成骨细胞的成骨作用和破骨细胞的骨重吸收作用处于动态平衡状态，打破这种平衡，特别是成骨活性的下降和破骨作用的增强，是导致骨密度降低的主要原因之一，但基因表达上是否在这两种细胞中表现出“拮抗”，还有待于研究。另外本研究还观察到，TGFβ和FGF2在骨组织中其他类型的细胞中也有表达，但较成骨、破骨细胞中表达量低，推测这可能与组织中细胞的不同分化类型和阶段有关。

　　通过培养的rBMSCs诱导实验发现杜仲具有刺激细胞FGF2表达的作用，而对TGFβ的表达无显著刺激作用，提示杜仲对这两种细胞因子的调节的途径不相同，对FGF2的调节是直接作用，而对TGFβ则是间接调节，是否通过杜仲的代谢产物对TGFβ进行调节，还有待于进一步研究证实。

　　【参考文献】

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　　[2] 张立，葛焕琦，白立纬，等.杜仲叶醇防治糖尿病合并去势大鼠骨质疏松症的实验研究[J].中国老年学杂志，2003，23(3):370-372.

　　[3] Nishimura R, Hata K, Ikeda F, et al. Signal transduction and transcripttional regulation during mesenchymal cell differentiation[J]. J Bone Miner Metab，2008, 26(2):203-212

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　　[7] Wei Y, Tamer H, Yebin J, et al. Basic fibroblast growth factor improves trabecular bone connectivity and bone strength in the lumbar vertebral body of osteopenic rats[J]. Osteoporos Int, 2005, 16: 1939–1947.

　　[8] Narayana Murthy PS, Sengupta S, Sharma S, et al. Effect of ormeloxifene on ovariectomy-induced bone resorption, osteoclast differentiation and apoptosis and TGF beta-3 expression[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2006, 100(4-5):117-128.