明胶和京尼平粘合自体颗粒骨修复兔桡骨缺损的实验研究
发表时间：2010-06-28 浏览次数：454次
作者：曾荣，吴少科，郭伟韬，谭志，胡资斌 作者单位：广东医学院附属医院 1.骨外科;2.放射科，广东湛江 524001
【摘要】 目的 探讨以明胶和京尼平粘合自体颗粒骨修复新西兰大白兔桡骨缺损的效果，为临床应用提供依据。方法 取24只新西兰大白兔制成双侧前臂桡骨中段骨缺损模型，并将切除的骨质磨成颗粒骨，随机分为A、B、C、D 4组，每组为6只，A组为空白组不填充任何材料;B组单纯填充明胶、京尼平;C组单纯植入400 mg自体颗粒骨;D组填充明胶、京尼平+200 mg自体颗粒骨。各组术后2、4、8周时各处死动物兔2只，取材检测，通过观察大体标本、X线片、组织学检查评估骨缺损修复能力。结果 在术后各时期，A、B组骨缺损模型均无骨愈合迹象，形成陈旧性骨缺损。术后C、D组均有良好的骨修复效果，但D组在防止颗粒骨移位流失、骨融合程度、新骨形成量、骨塑形改建方面优于C组。结论 明胶、京尼平具有粘合自体颗粒骨修复骨缺损的能力。
【关键词】 自体颗粒骨;明胶;京尼平;骨缺损
Autogenous morselized bone adhibited by gelatin and genipin for repair of radial bone defect in rabbit
ZENG Rong, WU Shaoke, GUO Weitao, TAN Zhi, HU Zibin (Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
Abstract: Objective To study the efficacy of autogenous morselized bone with gelatin and genipin for repair of radial bone defect in rabbit. Methods The segmental bone defects of bilateral radiuses were created in 24 New Zealand white rabbits. These rabbits were divided into 4 groups: group A received no implants, while group B, group C and group D were grafted with gelatin and genipin, 400 mg autogenous morselized bone, and 200 mg autogenous morselized bone with gelatin and genipin, respectively. The bone repair was assessed by gross specimen examination, Xray and histopathology at 2, 4 and 8 weeks. Results The bone defect repair was absent in group A and B, but excellent in group C and D. Position of morseliazed bone, bone fusion, new bone formation and bone moulding in group D were superior to those in group C.Conclusion Addition of gelatin and genipin in autogenous morselized bone can improve the repair of bone defect.
Key words: autogenous morselized bone; gelatin; genipin; bone defect
骨骼在损伤后有一定的自我修复能力，但广泛的骨缺损常常需要借助外科手段进行修复处理，准确的复位、有效的固定和充分的植骨是治疗的关键，其中自体骨移植应用广泛、疗效确切，被认为是骨缺损植骨的“金标准”[1]。自体颗粒骨移植治疗骨缺损是近年来出现的新的骨移植方式，颗粒骨主要应用于髋关节翻修时髋臼、股骨缺损的修复[2]，术后效果良好，其优点日益受到重视。但是其存在着结构松散、不易塑形、易移位、强度差等缺点。本实验拟利用明胶、京尼平粘附自体颗粒骨来检测其骨修复作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
新西兰大白兔24只，雄雌不限，体质量(2.3±0.2)kg，由广东医学院实验动物中心提供。明胶(240270，加拿大BIO BASIC INC公司),京尼平(日本和光纯药工业株式会社),西门子X线机，Nikon数码显微镜。
1.2 明胶、京尼平颗粒骨复合物的制备
将切除的兔桡骨在冰生理盐水中用磨钻磨成颗粒骨，离心备用。在40 ℃无菌状态下，明胶与水混合并呈胶水状，加入4 g/L京尼平溶液，并与颗粒骨充分混合，形成明胶京尼平粘合颗粒骨的复合物，用管状物简单塑形后直接放置于骨缺损部位。
1.3 实验动物模型的建立与分组
兔前臂尺挠骨远近端为先天性愈合，单纯进行其中一骨的手术可不进行内外固定，而不会影响其稳定性，故选此动物模型。新西兰大耳白兔24只48条前臂，体质量(2.3±0.2)kg。按每公斤体质量1 mL的30 g/L戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，前臂褪毛备皮，固定动物于手术台，消毒铺巾，取前臂外侧切口，长3.0 cm，推开趾长伸肌，即可暴露挠骨，距桡骨末端2 cm处为截点于近端1.5 cm处为第二截点，制成长1.5 cm桡骨骨缺损模型(图1a)，同时剔除表面骨膜及对应尺骨骨膜以防出现骨膜成骨的影响，冲洗术野，并将切除的骨质用磨钻磨成颗粒骨。新西兰兔随机分为A、B、C、D共4组，每组6只：A组为空白组不填充任何材料;B组单纯填充20 mg明胶+60 μL水+20 μL 4g/L京尼平;C组单纯植入400 mg自体颗粒骨;D组填充20 mg明胶+60 μL水+20 μL 4g/L京尼平+200 mg自体颗粒骨混合后在体外塑形，植入缺损部位(图1b)。缝合伤口，无菌敷料包扎，单笼饲养自由活动，全价标准饲料饲养，自由饮水，每日补充50g新鲜青饲料，术后每只肌注庆大霉素4万U，每天1次，共3d。术后2、4、8周时各处死动物兔2只，取材进行以下观察。
1.3.1 大体观察 观察术后各组实验动物的活动、进食及伤口愈合情况，术后各取材时间点过量麻醉将动物处死，取桡骨观察形态、材料吸收及坚固融合等情况。在2周时，取出材料观察材料表面纤维包膜形成情况及颗粒骨是否松散，移位。
1.3.2 X线检查 于术后各时间点进行X线检测，比较各组骨缺损区修复情况。
1.3.3 组织学检查 分别于手术后4、8周各处死每组2只动物。在距离骨缺损端约10 mm截断桡骨，将其置于体积分数为10%福尔马林溶液中固定，常规脱钙，梯度酒精脱水石蜡包埋，纵行切片HE染色，在普通光学显微镜下观察骨缺损修复及颗粒骨与周围骨质融合情况。B、D组取缺损段周围软组织切片检查，观察有无炎症异物反应。
2 结果
2.1 大体观察
各组动物术后第3天起正常进食、活动，手术伤口周围软组织未见红肿坏死，无炎性分泌物。A、B组骨缺损模型无骨愈合迹象，在4、8周时断端髓腔闭塞，缺损段为纤维组织连接(图2a)。术后2周时C组材料表面有纤维组织包裹，但颗粒骨有明显的松散、移位情况，不规则骨痂形成;D组可见移植物有纤维组织包裹，外形维持较好，骨痂规整，说明明胶、京尼平起到了粘合颗粒骨使其在包膜形成前不松散的目的。C、D组4周时颗粒骨之间及其截骨端形成坚固的骨质融合，其中C组外骨痂形成较为分散。C、D组在8周时骨缺损端均有良好的愈合效果，C组骨皮质凹凸不平(图2b)，D组塑形良好与正常桡骨无异(图2c)。
2.2 X线结果
A、B组各时间点均无骨愈合迹象，4周两骨断端有轻度硬化、增生，8周可见骨断端完全硬化，髓腔封闭，骨缺损略缩小(图3a)。C、D组2周时均可见颗粒骨变模糊说明颗粒骨之间及颗粒骨与周围骨质间有融合现象，C组模糊影较大，周围软组织处亦可见小许高密度影，表明植入颗粒骨较为松散、有游离;8周时，C、D组均有较满意的骨修复效果，髓腔相通，但D组塑形与正常桡骨形态相似(图3c)，C组塑形效果较差，仍有小许骨痂影(图3b)。
3.3 组织学观察
A、B组在8周时截骨端髓腔闭合，周围为纤维组织包裹。C组2周时可见颗粒骨表面及内部有大量胞浆丰富、多核的破骨细胞和胞浆较丰富、层状排列的成骨细胞对其进行重建，颗粒骨之间有较多的新骨形成，颗粒骨之间发生融合(图4a)。D组2周时组织学形态与C组相似，但由于粘附剂的作用使颗粒骨间隙小，骨间融合程度高，显“网格”状(图4b)。4周时C组外周骨已无法辨认颗粒骨外形，颗粒骨融合并有大片新生骨形成(图5a);D组外周骨已大量形成了片状、与长轴平行的骨板(图5b)。8周时，D组镜下表现与正常骨形态相似，髓腔相通，有正常皮质、骨小梁形态和骨髓细胞，骨细胞形态与正常骨质内骨细胞类似，成骨细胞数量明显减少，骨结构成熟(图6b);C组骨皮质表面较为粗糙，髓腔亦已相通，皮质骨尚为形成统一方向的骨板，仍有较多的破骨细胞参与塑形(图6a)。术后各时点B,D组缺损段周围软组织未见有炎症细胞浸润及细胞毒性及炎性异物反应等副作用，4周时两组骨缺损段组织切片未见有明胶样物残留。
3 讨论
尽管自体骨移植来源有限，取骨区易出现疼痛、感染、疝等并发症，其仍被认为是治疗骨缺损最好的方法,尤其新鲜自体骨移植修复骨缺损应用最为广泛。块状骨移植后,仅表面几毫米及与受区有血运密切接触的部分在短时间内能够成活,大部分移植骨成为死骨[3]。理想的骨移植材料应具备骨传导和骨诱导作用，近年来有关学者对颗粒骨进行了大量的研究，发现颗粒骨成骨效果好，而且骨诱导在小块骨和骨粉成骨中的作用比大段骨移植时更重要[3]。单纯颗粒骨移植存在结构松散，不易成型，并且强度低的缺点，所以临床仍局限髋臼植骨，以及填充椎间融合器进行椎体间植骨融合和脊柱后路固定融合等。
明胶是纤维、不溶蛋白、胶原等物质的水解产物，以多肽成分为主，具有组织相容性好、低抗原性、可降解、有胶粘性等特点，其在临床及实验研究领域应用广泛[45]。其主要缺点是在体温和液体环境下快速溶解，所以制备成植入体内的组织替代材料时一般要先经过交联等处理。京尼平是传统中药杜仲的活性成分之一，是一种新型的交联剂，可用其交联明胶、胶原等材料，其交联性能佳，经京尼平交联的明胶其耐水性明显提高，无细胞毒性[6]，在体内应用安全。本实验对植入粘合物的B、D组周围软组织观察亦证明其安全性。在前期实验中我们发现(另文发表)，明胶与京尼平混合后2 min内明胶仍呈胶水样，之后粘度逐渐增大，约10 min时失去粘性变为胶冻样物质，适合手术中进行混合颗粒骨，方便操作。
明胶、京尼平粘合颗粒骨材料植入体内2周仍维持较好的外形，无颗粒骨松散移位、流失，说明此材料达到了粘合颗粒骨使其不溃散的目的。此时C、D两组颗粒骨的修复重建情况相似，表明应用明胶、京尼平粘合颗粒骨移植后的缺血和血运重建再生过程和单纯颗粒骨移植相似，未出现明显影响其血运建立的情况，一可能与此明胶、京尼平在体内的降解时间较短;二与早期明胶、京尼平与颗粒骨均匀混合后，有较多孔隙，有利于组织营养液渗透，新生毛细血管的长入，血液循环建立有关。同时应用粘合材料可以使颗粒骨不松散，相互融合时间早、程度高。术后4周粘合材料吸收完全，骨改建塑形早，其与粘合组颗粒骨间隙少，骨间融合快、新骨形成多有关。
8周时C、D组均有良好的修复效果。应用粘合物由于可以克服早期移植的颗粒骨松散、移位，骨痂形成较为规整，新骨形成量多，板层骨形成较早，骨改建塑形所需的时间短，其修复效果更佳。
我们研究发现，利用明胶、京尼平粘合材料可以克服颗粒骨易松散、溃散，缺少支架固定的缺点，可以修复骨缺损，可用于局部无明显不稳定的大范围骨缺损的修复，如骨肿瘤等，为其临床应用提供依据。
【参考文献】
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