激素性股骨头坏死模型的建立及其发病机理的探讨

　　作者：王伟　刘利英　王坤正　马树强　党晓谦　时志斌　柏传毅　赵小鸽 作者单位：西安交通大学医学院：第二附属医院骨一科，陕西西安 710004;生物医学研究实验中心，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 建立兔激素性股骨头坏死模型，探讨其可能的发病机制。方法 用改进的马血清加甲强龙的方法诱导制备兔激素性股骨头坏死动物模型，通过X线检查及组织病理学方法观察坏死模型建立情况;采用免疫组化方法检测造模后2、4、8周兔股骨头内过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)及骨形态发生蛋白2(BMP2)的局部表达情况。结果 模型组双侧股骨头内骨质密度不均一，关节面模糊;骨小梁稀疏变细、断裂，骨小梁骨细胞空骨陷窝明显增多，脂肪细胞体积增大，数目增多，骨髓腔内造血组织明显减少。造模后2、4、8周时，模型组动物股骨头内PPARγ表达逐渐增强;BMP2在2周时呈阳性染色，4、8周时转阴性。结论 用改进的马血清加甲强龙的方法诱导制备兔激素性股骨头坏死动物模型，其病理变化及影像学改变符合临床典型的股骨头坏死的特征;激素性股骨头坏死的发生可能与PPARγ表达增强、BMP2表达减弱有关。

　　【关键词】 激素性股骨头坏死;动物模型;免疫组织化学;过氧化物酶体增殖体激活受体-γ;骨形态发生蛋白-2

　　Construction of the model of steroidinduced osteonecrosis in rabbits　and exploration of the pathogenesis of the osteonecrosis femoral head

　　Wang Wei, Liu Liying, Wang Kunzheng, Ma Shuqiang, Dang Xiaoqian, Shi Zhibing, Bai Chuanyi, Zhao Xiaoge

　　(the First Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004; the Central Laboratory for Biomedical Research,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To construct the model of steroidinduced osteonecrosis in rabbits and explore the pathogenesis of osteonecrosis femoral head. Methods We constructed the rabbit model of femoral head necrosis with the modified method of horse serum plus methylprednisolone. The osteonecrosis model was evaluated by Xray photograph and hematoxylin and eosin stain; immunohistochemistry was performed to detect the dynamics of the PPARγ and BMP2 expressions inside the femoral head of steroidinduced osteonecrosis in rabbits. Results Xray photograph showed that the femoral head was inhomogeneous in model group. In model group, there were increased numbers of empty bone lacunae and larger fat cells, decreased hematopoietic tissues compared with normal control group under light microscopy and histological staining. The expression of the PPARγ in model group at the 2th, 4th and 8th week was obviously higher than that of control group. Its expression had an upgrade tendency, with the longer time. The expression of BMP2 in model group was extremely lower than that in control group at the 2nd week. In 4th and 8th week, there was no expression of the BMP2 in model group. Conclusion The typical animal model of osteonecrosis is induced by the modified method of horse serum plus methylprednisolone. Inside the femoral head of steroidinduced osteonecrosis in rabbits, the expression of the PPARγ is upgraded; the expression of the BMP2 is inhibited.

　　KEY WORDS: femoral head necrosis; peroxisome proliferatoractived receptorgamma; bone morphogenetic protein2; animal model; immunohistochemsitry

　　股骨头缺血性坏死是临床常见的难治性疾病之一，其发病原因众多，发病机理尚不明确。该病临床上分为创伤性与非创伤性两大类，其中激素性股骨头坏死在非创伤性股骨头坏死中发病率居首位，并呈逐年增高的趋势。针对激素性股骨头坏死的原因学研究，国内外学者提出了多种假说，但迄今尚无一种学说可以完全解释其发病机理。建立激素性股骨头坏死动物模型时间长、成本大、成功率低、动物死亡率高，因此对造模方法的研究仍将是长期面临的一项课题。在本研究中我们通过对已有造模方法进行改进，试图寻找一种新的效率更高的造模方法，并在此基础上对激素性股骨头坏死的发病机理进行了进一步的探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康成年新西兰白兔35只(西安交通大学实验动物中心)，雌雄各半，体重2.6-3.2kg，平均2.9kg。颗粒饲料喂养，单笼饲养。

　　1.2 主要仪器与试剂 Rabbit AntiPPARγ、Rabbit AntiBMP2、羊抗兔二抗(博士德生物工程有限公司);兔SP检测试剂盒(SP9001，中杉金桥);马血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，甲强龙(美国辉瑞生物制药公司);多聚赖氨酸、多聚甲醛(博士德生物有限公司);二甲苯、无水乙醇、乙二胺四乙酸二钠(天津市化学试剂六厂)。柯达计算机X线摄影成像系统/CR;RM2135石蜡切片机(德国Leica 公司);数显恒温水浴锅HH2(国华电器有限公司);2022AB电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);显微镜(Motic);W550CW型图像信号采集与分析系统(德国Leica公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物模型制作及分组 动物适应性喂养1周后，精确称重，随机分为正常对照组(15只)和模型组(20只)。两组动物在体重及雌雄数等方面经t检验差别无统计学意义。首次应用马血清10mL/kg，经兔耳缘静脉注射，间隔3周后，马血清减量为6mL/kg经兔耳缘静脉再次注射;间隔2周后，腹腔注射甲基强的松龙，按45mg/kg连续3d，每天注射1次。注射激素期间，每天每只动物腹腔注射青霉素10万单位，连续7d，预防感染。正常对照组动物常规饲养。

　　1.3.2 X线检查 于最后1次激素注射后，4周末，两组各取4只动物，氯胺酮复合麻醉(安定3.5mg/kg肌注15min后，氯胺酮25mg/kg肌注)后，拍双髋正位X线片。

　　1.3.3 病理组织学检查 于最后1次激素注射后2、4、8周末，两组随机各取4只动物，氯胺酮复合麻醉(同1.3.2)后，备皮、消毒、固定动物。严格无菌手术下，取出双侧股骨头，沿冠状面剖开，冷PBS冲洗后，将所取标本置于10%(体积分数)中性甲醛溶液(0.1mol/L, pH=7.4)固定3d，然后置于10%(体积分数)EDTATris缓冲液中脱钙, 每周更换脱钙液1次，观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度。脱钙完全后取材，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片行HE染色。光镜观察骨组织、骨髓组织、骨小梁及髓内脂肪组织的变化。

　　1.3.4 免疫组化染色 如上法制备石蜡切片，常规免疫组化染色。其中PPARγ和BMP2抗体稀释均为1∶100，与辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗兔二抗(1∶500)室温孵育2h后，用DAB显色。以PBS代替一抗作阴性对照。棕色颗粒代表PPARγ和BMP2的阳性表达。应用Leica公司的Qwin软件分析免疫组化的结果。每只动物随机选取3张切片进行免疫组化染色，每张切片随机选取10个(×200)视野，分析灰度值，取其均值代表本张切片的灰度值，3张切片灰度值的均值为该动物免疫组化染色的灰度值。染色的深浅度与灰度值成反比，即组织细胞中PPARγ和BMP2的表达越强，染色越深，灰度值就越低。

　　1.4 统计学处理 使用SPSS10.0版统计软件，采用t检验的方法进行组间数据的比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 病理组织学观察 正常对照组：骨小梁完整，排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常;模型组：骨小梁稀疏变细，结构紊乱，有碎片出现，骨小梁骨细胞陷窝空疏，骨细胞核固缩，骨髓腔内造血组织明显减少，细胞数目及网状结构较正常稀疏，脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状(图1)。股骨头软骨下区空骨陷窝率及骨髓腔内脂肪细胞直径的变化见表1。

　　表1 两组造模后2、4、8周末空骨陷窝率及髓腔脂肪细胞直径的比较(略)

　　Tabel 1 Comparison of empty bone lacuna rate and diameter of fat cell between model and control groups at the 2nd, 4th, and 8th week

　　*P<0.05 vs. control group; **P<0.05 vs. week 2

　　图1 正常对照组和模型组的HE染色结果(略)

　　Fig.1 HE staining observation of control and model groups (×400)

　　A: control group, few empty osteocyte lacunae and many hematopoietic cells were seen; B: model group, a lot of empty osteocyte lacunae, decreasing hematopoietic cells and hypertrophy fat cells were seen

　　2.2 X线检查结果 正常对照组股骨头形态完整，关节面清晰，股骨头骨密度均匀(图2A);模型组股骨头关节面模糊，骨质结构不清楚，股骨头骨质密度不均匀(图2B)。

　　图2 正常对照组和模型组于造模后4周双侧X线表现(略)

　　Fig.2 After injecting steroid 4 weeks, the Xray photograph of control and model group

　　A: control group: intact articular surface with uniformity sclerotic structure of femoral head; B: model group: blurry intact articular surface with unclear sclerotic structure of bilateral femoral heads

　　2.3 PPARγ及BMP2的表达 正常对照组股骨头髓腔内骨髓基质干细胞中PPARγ和BMP2呈弱阳性表达(图3A、B);模型组BMP2表达于造模后2周较对照组减弱(图3C)，4、8周呈阴性表达;模型组PPARγ表达于造模后2周呈阳性、4、8周均呈强阳性表达，与同时期对照组比较均有显著性差异(图3D、E、F)。

　　图3 不同时间点股骨头髓腔内骨髓基质干细胞中PPARγ和BMP2表达(略)

　　Fig.3 The dynamic expressions of the PPARγ and BMP2 inside the femoral head

　　A: normal bone marrow PPARγ weakly positive expression; B: normal bone marrow BMP2 weakly positive expression; C: after 2 weeks bone marrow BMP2 decreasing expression; D: after 2 weeks bone marrow PPARγ expression; E: after 4 weeks bone marrow PPARγ expression; F: after 8 weeks bone marrow PPARγ expression (×400)

　　3 讨论

　　自Pietrogrand和Mastomarine于1957年首先报道了短期大剂量使用糖皮质激素可致股骨头坏死以来[1]，国内外学者对激素性股骨头坏死进行了大量的研究，并相继提出了脂肪代谢紊乱学说、血管内凝血学说及骨质疏松学说等，但确切发病机理迄今仍未明了[23]。兔常被用于建立激素诱导性股骨头坏死模型，但糖皮质激素的用量、类型和股骨头坏死的发病率各家报道不一;同时，在建立股骨头坏死模型过程中，单独应用激素还是联合应用一些辅助制剂(如内毒素、马血清等)各家意见尚存分歧。现在虽然有人认为单纯应用激素不能诱导动物产生股骨头坏死这一理论过于武断[4]，但在临床实际中不会对正常人应用大剂量激素，或是长期小剂量应用激素，只是在肾病综合征、感染性休克、妊娠并发症、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病时应用激素较多，且较容易出现股骨头坏死的并发症。这就说明在大部分激素性股骨头坏死的临床病例中，在应用激素以前机体已经有血液系统和脉管系统的病变基础或者有免疫系统失调，那么在建立股骨头坏死动物模型应用激素前，加用一些辅助制剂造成血液系统和脉管系统病理改变后，再应用激素，这样更接近临床发病及治疗情况，由此建立的动物模型更有利于对临床治疗及预防的研究。事实上，在加用辅助制剂后建立模型的效率会大大提高，造模时间相对缩短[56]。

　　用马血清致动物出现Ⅲ型变态反应，抗原抗体复合物沉积在血管壁上引起超敏性血管炎，此后应用糖皮质激素可抑制胶原和弹性纤维的合成，进而导致小动脉断裂或栓塞，髓内出血，最终导致股骨头坏死。同时，激素诱导骨髓脂肪化，脂肪细胞增生肥大，成骨细胞减少;髓内压升高，血管受压，脂肪损害血管内皮局部血栓形成，或脂肪栓塞进一步导致骨坏死的发生[7]。Matsui等人[8]用马血清使兔出现过敏性血管炎，进而用激素诱导兔ANFH模型，组织切片观察发现4-6周后出现骨髓坏死，6-8周后出现骨坏死。Nakata等人[9]采用间隔3周2次注射马血清制作骨坏死模型，观察到红细胞外渗及小动脉微血栓是骨坏死的早期病理改变。这种病理改变与骨髓及肾小球内免疫复合物沉积关系密切。虽然，他们建立了典型的骨坏死模型，但都没有提及造模动物的死亡率。本研究用马血清10mL/kg(间隔3周)耳缘静脉注射两次，进行预实验时发现，动物死亡率极高(预实验6只兔子，死亡5只，均在2次马血清注射后5min内发生死亡)。故本研究对以往造模方式进行了改进：应用马血清10mL/kg，经兔耳缘静脉注射，间隔3周，按6mL/kg的剂量经兔耳缘静脉再次注射马血清;间隔2周后，腹腔注射甲基强的松龙，按45mg/kg连续3d，每天注射1次。在第2次静脉注射马血清时，降低马血清用量使动物的死亡率大大降低(1/20，1只兔子死亡而且发生在2次马血清注射后第2天)。本实验结果显示这种方法可以建立典型的股骨头坏死的动物模型，而且，动物死亡率大大降低。国内虽有类似的研究[10]，但本研究在马血清的用法上更为简单。

　　近年来，在激素性股骨头坏死发病机理的研究中，有人提出激素的应用诱导骨髓基质干细胞向脂系分化增强同时向骨系的分化减少[11]。这一细胞分化方向的改变在股骨头坏死的发病过程中起重要作用。本研究选择骨髓基质干细胞向上述两个方向分化时，两种重要的标志性蛋白PPARγ及BMP2进行免疫组化检测以进一步研究激素性股骨头坏死的发病机理。实验结果显示，造模动物于造模后2、4、8周PPARγ的表达逐渐增强，且与对照组比较表达明显增强(P<0.05)。相反，造模后2周，造模动物BMP2弱表达，以后时段无明显表达[12]。故这是否提示激素诱导骨髓基质干细胞使其高表达促成脂蛋白而降低表达促成骨蛋白，进而导致骨髓脂肪化、骨坏死发生，尚有待进一步研究。

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