大鼠增龄过程中骨质疏松与椎间盘退变的相关性分析

　　作者：张银刚　李天清　王金堂　郭雄 作者单位：西安交通大学医学院：第一附属医院骨科;环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 研究大鼠增龄过程中骨质疏松症和椎间盘退变的相关性。方法 50只健康纯种SD大鼠，喂养22个月，建立老龄大鼠模型，进行股骨、胫骨、腰椎等组织学观察，并评价椎间盘退变的相关指标(椎间盘软骨Ⅱ型和Ⅹ型胶原表达、软骨终板血管芽相对面积、软骨终板钙化层/非钙化层厚度)与骨质疏松的相关指标(骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、骨密度、骨最大应力和应变)的相关性。结果 骨质疏松相关指标骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨密度、椎体骨密度与椎间盘退变指标终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原定量之间存在中度到强度的负相关，而与Ⅹ型胶原表达存在中度到强度的正相关，其中椎体骨密度与软骨终板的Ⅹ型胶原相关性最强。骨生物力学指标最大变形和最大负荷与椎间盘退变的各个指标无相关性。结论 骨质疏松和椎间盘退变呈负相关，这种相关并不能完全归因于环境因素;而骨生物力学最大变形、最大负荷和椎间盘退变无相关性。

　　【关键词】 骨质疏松症;椎间盘;老龄大鼠

　　Analysis of the correlation between osteoporosis and degeneration of intervertebral disc in the aging rat

　　Zhang Yingang, Li Tianqing, Wang Jintang, Guo Xiong

　　(Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University; Key Laboratory of Environment and Genes Related　Dieases of Ministry of Education, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the correlation between osteoporosis and degeneration of intervertebral disc in the aging rat. Methods Fifty healthy SD rats were fed for twentytwo months in order to build the model of aging rats, the histology of femoral bone, tibial bone and lumbal vertebra was used to observe, then we evaluated the indexes which reflect the degeneration of intervertebral disc including the quantity of collagen type Ⅱ, Ⅹ of intervertebral disc by the immunohistochemistry methods, the relative area of vascular bud, the thickness of calcified layer and uncalcified layer on cartilage endplate and the indexes which reflect the osteoporosis including the thickness ratio of cortical bone, the relative area of bone trabecula, the bone density, the max stress and straining of bone. Results There was moderate or strong negative correlation among the indexes of the degeneration of intervertebral disc including the relative area of vascular bud, the ratio of the uncalcified and the calcified layer, the quantitation of collagen type Ⅱand the indexes of osteoporosis including the thickness ratio of cortical bone, the relative area of bone trabecula, the density of femoral bone and vertebral body bone, the max stress and straining of bone. However, there was moderate or strong positive correlation with the quantitation of collagen type Ⅹ, of which the bone density of vertebral body had the strongest dependablity with collagen type Ⅹ. And the indexes of bone biomechanics including the max stress and straining had no correlation with the indexes of degeneration of intervertebral disc. Conclusion Osteoporosis has negative correlation with the degeneration of intervertebral disc, which is not distributed to the environment factors; but the indexes of bone biomechanics including the max stress and straining have no correlation with the indexes of degeneration of intervertebral disc.

　　KEY WORDS: osteoporosis; intervertebral disc; aging rat

　　骨质疏松和椎间盘退变都是和增龄有密切相关的病理过程，有学者提出两种病理过程可能存在一定的相关性，有相似的发病机制[1]。但最近，流行病学调查显示，骨质疏松症和椎间盘退变症的患病呈负相关[2]，部分学者把这种结果归于环境因素，认为直立行走及活动所致的过多应力增加了骨矿密度，同时增加了椎间盘的“劳损”，加速了椎间盘的退变。然而，目前缺乏更多的证据支持这种假说。在前期研究中，我们发现终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原单克隆免疫组化定量分析是评估增龄性椎间盘退变的灵敏指标。因此，本实验将分析这些指标和骨质疏松指标的相关性，以期揭示在增龄过程中骨质疏松和椎间盘退变的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器 Ⅱ、Ⅹ型胶原鼠单克隆抗体由德国ErlangenNumberg大学分子生物学实验中心提供;碱性磷酸酶-生物素标记的抗鼠IgG由华美生物有限公司提供;透明质酸酶、链酶蛋白酶、蛋白水解酶、3hydroxy2naphthylocid2, 4dimethylaniline、Fast red均来自美国Sigma公司。高清晰病理图像分析仪为北航医学生物公司产品;组织切片机为德国Ainca公司产品;QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪和电子万能生物力学试验机为美国PE公司产品。

　　1.2 实验动物和方法

　　1.2.1 大鼠老龄性模型的建立 取同批健康纯种SD大鼠50只(由西安交通大学动物实验中心提供)，雌性，全部饲养条件一致，自由摄食，喂以大鼠标准饲料，饮用蒸馏水，达22月，体重为220-310g，未曾生育，处死作为老龄大鼠组(年龄22月)。

　　1.2.2 取材 实验动物在20g/L乌拉坦溶液麻醉下，腹腔动脉抽血处死，取动物双侧后肢股骨、胫骨，腰椎等组织，分别固定于40g/L多聚甲醛溶液中或放置于低温冰箱保存待用。其中L1、L2椎体和左股骨用于进行骨密度检测，左侧股骨检测完骨密度后再行生物力学实验，右下肢和L3、L4用于作组织学检查。

　　1.2.3 形态学检查 分取L3-4脊柱节段，包括L3、L4椎体及L3-4椎间盘，股骨中1/2处，胫骨中上段(包含膝关节)，经40g/L多聚甲醛溶液固定，80g/L的中性EDTA脱钙液脱钙40d，常规石蜡包埋，用90g/L的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，每张6-8μm，HE染色。

　　1.2.4 免疫组化方法测定Ⅱ、Ⅹ型胶原表达 椎间盘组织切片用二甲苯脱蜡、逐级乙醇水化后，用透明质酸酶(Hyaluronidase 2g/L)室温孵育30min。Ⅱ型胶原用链霉蛋白酶(Pronase 1g/L)，Ⅹ型胶原用蛋白酶(Protease 0.02g/L)室温处理30min，加入一抗在4℃孵育过夜，用碱性磷酸酶生物素标记的第二抗体孵育30min。用3hydroxy2naphtylocid 2, 4dimethylanilid在室温下进行呈色反应。细胞核用苏木素复染，用水溶性封片剂封固观察。阳性表达为基质和细胞周围出现红染颗粒，应用图像分析系统进行灰度扫描并分析，灰度扫描切片细胞核不复染。

　　1.2.5 软骨终板血管芽相对面积测量 取HE染色切片，低倍光学显微镜下(×40)计数软骨终板血管芽数(头侧和尾侧血管数之和除2)。血管面积占终板区域相对数使用方格法(图1)。各组取10个标本，各个标本连续8μm横断面切片2张，显微镜下采集图像，尺寸定标，形成图形数据，医学图像分析软件自动分析。

　　1.2.6 软骨终板钙化层、非钙化层厚度测量 采用HE染色切片，以潮标为分界线，40倍显微镜下，测定每组椎间盘软骨终板正中矢状面的前侧1/3、中心点、后侧1/3钙化层和非钙化层的厚度，取3处测量的平均值，计算非钙化层/钙化层比值(图2)。

　　图1 血管面积相对数计算示意图(略)

　　Fig.1 The relative area of blood vessel (HE×100)

　　图2 软骨终板钙化层、非钙化层厚度测量(略)

　　Fig.2 The measurement of cartilage endplate (HE×100)

　　1.2.7 骨皮质厚度指数测量 取股骨中部横断面HE染色切片，光学显微镜下测量计算骨皮质厚度指数，计算方法如下：

　　骨皮质厚度指数=AB+CD/AD

　　其中AB、CD、AD如图3所示(4-8个部位处测量后求均值)。

　　1.2.8 骨小梁相对面积测量 胫骨中上的石蜡切片经HE染色后应用图像分析系统分析测量。以关节软骨1mm以下的松质骨区域，每张切片测量3个视野(×40，测定面积限定为274753μm2)，取平均值，测量平均骨小梁相对面积。

　　图3 骨皮质厚度指数测量示意图(略)

　　Fig.3 The index of bone cortical thickness

　　1.2.9 骨矿密度测定 用QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量四肢骨与腰部椎体骨矿密度，放射源为镅241Am，误差≤3%。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，每次放入7个标本。使用Regional high resolution QDR 4500小动物分析软件。

　　1.2.10 生物力学测定 右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验，观察最大应力和应变。当外力作用于骨时，骨以形变产生内部的阻抗来抗衡外力，即骨产生的应力，用最大负荷力表示，单位为g/cm2。应变是指骨在外力作用下的变形，用应力作用后至断裂的最大位移距离表示，单位为厘米。测量时，调整两个约束支架相距20mm，将大鼠股骨比较均匀的部位放在约束支架上，股骨的短轴与垂直方向平行，逐级加压直至破坏，读取导致破坏的负荷的数据。待测标本用生理盐水保持湿润，荷载测量精度为0.1N(牛顿)，变形测量精度为0.001mm。

　　1.3 统计学处理 所有数据输入计算机，用SPSS 10.0 for windows软件进行变量Pearsons相关分析，计算结果以均值±标准差(±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 组织学观察 老龄大鼠出现了骨质疏松的征象，如骨小梁稀疏，排列不整，骨小梁间隙增大，骨小梁面积比增大等;同时出现了椎间盘退变的征象，如软骨终板血管芽减少，纤维环排列不规则等。各个相关指标检测结果见表1。

　　2.2 骨质疏松和椎间盘退变的相关性分析 骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨骨密度、椎体骨密度与终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原表达定量之间存在中度到强度的负相关，和Ⅹ型胶原表达定量之间，存在中度到强度的正相关，其中椎体骨密度与软骨终板的Ⅹ型胶原表达相关性最强(图4)。椎间盘退变的相关指标不仅与邻近椎体的骨密度相关，而且与遥远部位股骨的骨密度相关。但是，生物力学指标最大变形和最大负荷与椎间盘退变的各个指标无相关性。

　　表1 老龄大鼠骨质疏松和椎间盘退变相关指标的检测结果(略)

　　Table 1 The values of the indexes of the osteoporosis and the degeneration of intervertebral disc in the aging rat

　　图4 椎体骨密度和软骨终板Ⅹ型胶原表型表达的相关性分析(略)

　　Fig.4 The correlation analysis of the bone density of vertebral body and the phenotypic expression of collagen type Ⅹ on cartilage endplate

　　3 讨论

　　本实验结果显示，骨质疏松和椎间盘退变相关指标呈现不同程度的负相关，其中椎体骨密度和椎间盘退变相关性最强，这些结果与人类的流行病学研究相一致[2]。

　　骨质疏松症(osteoporosis, OP)是骨骼的骨基质和骨矿物质丧失所致的一种骨代谢性疾病，以骨显微结构改变、单位骨体积骨量减少和骨生物力学改变为特征。本实验构建的老龄雌性大鼠模型，骨形态学显示出现了骨质疏松的征象。为了反映骨质疏松的特点，本实验测量并分析骨形态计量学、骨矿密度、骨生物力学等指标。这些指标包括骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨骨密度、椎体骨密度、最大负荷(N)、最大变形(mm)之间，存在中度到强度的相关性，这些结果和骨质疏松症的临床表型是一致的。

　　本实验分析显示，椎间盘退变的指标如终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原定量之间，同样存在中度到强度的正相关性，和Ⅹ型胶原定量之间，存在中度到强度的负相关性。这些结果和增龄性椎间盘组织学变化及机制是相符的[3]。

　　对于骨质疏松和椎间盘退变相关指标相关性分析显示，骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨骨密度、椎体骨密度和终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原表型表达定量各个指标之间，存在中度到强度的负相关，而和Ⅹ型胶原表型表达定量之间，存在中度到强度的正相关。这表明在增龄性过程中，骨密度和椎间盘退变呈正相关，骨质疏松和椎间盘退变呈负相关，这与人类的流行病学研究相一致。但是在实验中发现，生物力学指标最大变形和最大负荷与椎间盘退变的各个指标无相关性，虽然理论上讲，骨密度和最大变形、最大负荷呈正相关，但这与椎间盘退变时椎体较易发生骨折并不矛盾[4]。

　　由于考虑到椎体骨密度容易受局部环境的影响，本实验同时还分析股骨骨矿密度与椎间盘退变的关系，同样支持在增龄性过程中，骨质疏松和椎间盘退变呈负相关的结果。

　　由于采用了爬行动物大鼠作为试验动物，应力的作用被大大降低，但仍得出骨质疏松和椎间盘退变呈负相关的结果。这表明“应力学说”并不能满意解释骨质疏松和椎间盘退变呈负相关这一现象。

　　对于骨质疏松和骨关节炎呈现负相关的机制研究发现，在骨密度较高的骨关节炎骨中有较高的胰岛素生长因子和转化生长因子[5];在遗传学方面研究发现，骨质疏松和骨关节炎存在不同的遗传基础[6]。在椎间盘退变方面的研究刚刚起步，是否也存在类似的基础，还需要进一步研究。

　　本实验研究显示，骨质疏松和椎间盘退变呈负相关，这种相关并不能完全归因于环境因素;而骨生物力学最大变形、最大负荷和椎间盘退变无相关性。

　　【参考文献】

　　[1]张银刚,郭雄. 椎间盘退变的病理机制及其修复的生物学进展 [J]. 中华骨科杂志, 2004,24(2):119121.

　　[2]Miyakoshi N, Itoi E, Murai H, et al. Inverse relation between osteoporosis and spondylosis in postmenopausal women as evaluated by bone mineral density and semiquantitative scoring of spinal degeneration [J]. Spine, 2003, 28(5):492495.

　　[3]Zhang YG, Guo X, Xu P, et al. Bone mesenchymal stem cells transplanted into rabbit intervertebral discs can increase proteoglycans [J]. Clin Orthop Relat Res, 2005, 430:219226.

　　[4]SornayRendu E, Munoz F, Duboeuf F, et al. Disc space narrowing is associated with an increased vertebral fracture risk in postmenopausal women: the offely study [J]. J Bone Miner Res, 2004, 19(12):19941999.

　　[5]Irlenbusch U, Dominick G. Investigations in generalized osteoarthritis. Part 2: special histological features in generalized osteoarthritis [J]. Osteoarthritis Cartilage, 2006, 14(5):428434.

　　[6]Ogata N, Shiraki M, Hosoi T, et al. A polymorphic variant at the Werner helicase (WRN) gene is associated with bone density, but not spondylosis, in postmenopausal women [J]. J Bone Miner Metab, 2001, 19(5):296301.