人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的构建

　　作者：李新友，王金堂，刘淼，王全颖，杨广笑，李萌 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院骨科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 为了研究人骨形态发生蛋白7(hBMP7)导入骨缺损模型中的治疗作用，构建重组腺病毒载体。方法 将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMVplpA，构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒，应用磷酸钙DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞，经细胞内同源重组后，构建骨形态发生蛋白7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7。结果 成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7，经293细胞包装后，扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论 成功构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7，为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。

　　【关键词】 骨形态发生蛋白7;腺病毒载体;基因转移;滴度测定

　　The construction of hbmp7 recombinant adenovirus vector

　　Li Xinyou, Wang Jintang, Liu Miao, Wang Quanying, Yang Guangxiao, Li Meng

　　(Department of Orthopedic, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective In order to investigate the treatment of bone defect repairing by recombinant adenovirus transudation the hBMP7 gene, the vector of hPMP7 recombinant Ad was constructed. Methods The gene of hBMP7 was inserted into the replicated defective adenovirus shuttle plasmid pACCMVplpA. We constructed the vector of hBMP7 recombinant Ad. The recombinant Ad viral stock was packaged. Totally 293 cells were cotransfected with the rAd vector of plasmid pACCMV/rhBMP7 and packaging plasmid PJM17 by calcium phosphate precipitation. Results The recombinant viral vector of plasmid pACCMV/rhBMP7 was constructed successfully. We got the Ad pACCMV/rhBMP7 stocks of high tire 1×1011 pfu/mL. Conclusion We prepared the viral stock of rAdBMP7 that can serve as the experimental study of gene therapy of bone defect repairing.

　　KEY WORDS: bone morphogenetic protein; recombinant adenovirus; gene transfer; titration

　　随着分子生物学及转基因技术的飞速发展，利用骨形态发生蛋白(bone morphorgenetic protein, BMP)进行基因治疗，为骨缺损、骨不连的修复提供了一条新途径。骨缺损的基因治疗是将BMP等外源性目的基因导入细胞，外源性基因在体内表达功能性蛋白，达到治疗目的。基因治疗的关键是基因转移，高效病毒载体的发展是基因治疗付诸于临床应用的一个重要因素。腺病毒具有安全性好，宿主范围广，容易得到高滴度的重组病毒等优点，使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一[1]。腺病毒作为载体进行转基因时，转染细胞的目的基因表达是暂时性高水平表达，这对于骨组织修复特别理想。所以，本研究构建骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 质粒、菌株、细胞株。pGEMThBNP7 质粒由作者构建。腺病毒穿梭质粒pACCMVplpA及辅助质粒PJM17和E.coli DH5α由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶(BamHⅠ，Hind Ⅲ)及T4DNA连接酶、胰蛋白酶、蛋白酶K购自西安华美生物工程公司。293工程细胞系由西安华广生物工程公司提供。

　　1.2 实验方法 ①重组质粒pGEMThBMP7 及腺病毒穿梭质粒pACCMVplpA用碱裂解法大量制备。用限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ联合酶切质粒pGEMhBMP7和pACCMVplpA，制备并连接带有相同黏性末端的质粒及全长hBMP7目的基因。②用连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coli DH5α菌株，涂于含IPIG的琼脂板上，挑选单菌落接种于LB培养液中，碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，筛选出含有1.3ku左右的重组质粒pACCMV/rhBMP7。③将大量制备的pACCMV/rhBMP7和辅助质粒pJM17应用磷酸钙DNA共沉法，转染293细胞。显微镜下见到293细胞表面有细密的沉淀形成。静置4h，去转染液，更换固体培养基，放入孵育箱。10d后，质粒在细胞内同源重组产生出活重组腺病毒，病毒斑出现。继续感染293细胞，扩增病毒。④重组病毒颗粒的回收与纯化。给培养液中加入细胞悬液，反复冻融，透析离心取上清，用蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒。 ⑤病毒滴度测定。取出11个消毒好的试管，取毒种0.2mL，10倍稀释，顺次将毒种稀释至10-11。接种于单层细胞吸附1h后，更换固体培养基，孵育7d后数斑，计算滴度。

　　2 结果

　　2.1 重组腺病毒pACCMV/rhBMP7穿梭质粒的构建 5型腺病毒pACCMVplpA穿梭质粒全长8.8ku，用BamHⅠ和HindⅢ两酶联合消化后可获得具有两个黏性末端的开环质粒。pGEMTBMP7质粒全长为4.3ku，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，可获得具有黏性末端的BMP7目的基因1.3ku和3.0ku的开环T载体质粒。连接腺病毒穿梭质粒和BMP7目的基因，构建成pACCMV/rhBMP7重组腺病毒穿梭质粒，全长约10.1ku。构建简图如图1。

　　2.2 重组腺病毒穿梭质粒pACCMV/rhBMP7的酶切分析 质粒pACCMV/rhBMP7上分别有BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ酶切位点。当用BamHⅠ/HindⅢ双酶切时，可得到8.8ku和1.3ku两个片段;当用PstⅠ单酶切时，可得到线性化的开环质粒10.1ku。实际结果与理论推导符合(图2)。

　　2.3 重组腺病毒AdBMP7的滴度测定 将所获得的病毒液对数比稀释后，再次感染培养于固体培养基的293细胞，一周后数病毒斑测定滴度为1011pfu。

　　3 讨论

　　骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP7)具有诱导未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化作用，和在骨折和骨缺损的修复过程中发挥重要作用[26]。随着基因转移技术的发展，将外源目的基因导入靶细胞，通过靶细胞表达外源基因进而发挥作用。

　　图1 骨形态发生蛋白7重组腺病毒质粒pACCMV/BMP7的构建(略)

　　Fig.1 Construction of recombinant plasmid pACCMV/BMP7 viral vector

　　图2 重组腺病毒质粒pACCMV/BMP7的鉴定结果(略)

　　Fig.2 Assessment of recombinant plasmid pACCMV/BMP7 viral vector

　　A: λDNA/HindⅢ Mark; B: 100bp DNA ladder; C: BamHⅠ/HindⅢ double enzymes restriction analysis; D: PstⅠ single enzymes restriction analysis; E: pACCMV/BMP7 plasmid as control

　　腺病毒(adenovirus, Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，使其成为当今使用最多的病毒载体之一。腺病毒载体具有以下优点[78]：①对其结构及特性清楚，容易复制，操作简单、易于制备;②宿主范围广，既可感染分裂期细胞又可感染非分裂期细胞;③重组病毒载体可获得较高的滴度，约1011-1012pfu/mL;④病毒基因存在于细胞染色体外，避免了基因因整合引起的细胞突变，致癌的可能性小，基因毒性低;⑤用它制备成疫苗或表达载体安全性好;⑥腺病毒载体容量较大，可插入7.5ku的外源基因;⑦理化性质稳定经得起纯化和浓缩。由于腺病毒载体以上优点，其作为外源基因转染机体细胞的表达载体，广泛应用于各种疾病的基因治疗。我们应用磷酸钙DNA共沉法将腺病毒穿梭质粒pACCMV/rhBMP7与辅助质粒PJM17共转染293细胞，在细胞内同源重组，构建出Ad pACCMV/rhBMP7重组腺病毒。骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建，为采用基因治疗方法进行骨缺损修复奠定了良好的基础。

　　【参考文献】

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