非洛地平对SD大鼠骨组织形态学的影响

　　作者：宋金辉，陈军，王伟卓，邹春雨，阎宏伟，王坤正 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院骨科，陕西西安 710004;2. 陕西电子409医院骨科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 明确非洛地平灌胃对SD大鼠骨质代谢的作用，确定其对骨质疏松的影响，为临床用药提供直接的动物实验证据。方法 SD大鼠132只，随机分为对照组及非洛地平高、中、底剂量组。对照组每天给予蒸馏水灌胃，非洛地平高、中、低剂量组分别每天给予非洛地平0.15、0.45、1.25mg/kg体重灌胃。3、4、5、6月后进行右侧股骨全长HE染色，计算平均骨小梁密度(MTPD)、平均骨小梁间距(MTPS)、平均骨小梁厚度(MTPT)、骨小梁间连接点数(TB.n)、骨小梁末端数(FFT)等静态参数。结果 ①3、4个月后，各组大鼠以上指标均无明显差异(P>0.05);②5个月后，非洛地平高、中剂量组与正常对照组和低剂量组相比MTPD、MTPT、TB.n明显减低(P<0.05)，MTPS、FFT则明显增加(P<0.05);③6个月后，非洛地平低剂量组与其他组相比，MTPD、MTPT、TB.n均明显增加(P<0.05)，MTPS、FFT明显减少(P<0.05);而非洛地平高、中剂量组相比正常组，MTPD、MTPT、TB.n均明显减少(P<0.05)，MTPS、FFT明显增大，高剂量组尤甚(P<0.05，P<0.01)。结论 非洛地平短期应用对大鼠股骨组织学结构无影响。随着用药时间的延长，中、高剂量能引起骨丢失;低剂量则能抑制骨吸收，利于向增加骨强度的方向发展，有效地保护骨骼。

　　【关键词】 非洛地平;骨组织形态学;大鼠;骨质代谢;骨质疏松

　　YAN Hongwei1, WANG Kunzheng1

　　(1. Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Orthopedic Surgery,

　　No.409 Electrical Technology Hospital, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effects of felodipine on sclerotin metabolism of SD rats through intragastric administration and ascertain its effect on osteoporosis in order to afford animal experiment evidence for clinic. Methods The 132 SD rats were randomly divided into control group, felodipine highdose group, mediumdose group, and lowdose group. The groups of high, medium and low dose were intragastrically administered with felodipine 0.15mg/kg, 0.45mg/kg and 1.25mg/kg, separately. The control group was intragastrically administered with distilled water. Total length of the rats right lateral thigh was dyed with HE; the average bone trabecula density (MTPD), distance (MTPS), average bone trabecula thickness (MTPT), average bone trabecula conjunction number (TB.n) and average bone trabecula termination were calculated in 3, 4, 5, 6 months. Results ① Insignificant difference was found among the groups after 3, 4 months (P>0.05). ② Five months later, MTPD, MTPT and TB.n were found significantly lower in felodipine high and mediumdose groups than in lowdose group (P<0.05). However, MTPS and FFT increased significantly(P<0.05). ③ Six months later, MTPD, MTPT and TB.n were found increased significantly in felodipine lowdose group than in the others (P<0.05), but MTPS and FFT decreased significantly (P<0.05). The results of MTPD, MTPT and TB.n were found decreased while MTPS and FFT were found increased significantly in felodipine high and mediumdose groups compared with those in control group (P<0.05), especially in highdose group. Conclusion No significant effect on rat bone microarchitecture was found in felodipine shortterm administration. Using felodipine of high or medium dose can result in bone loss with the time extension. Lowdose felodipine can inhibit bone absorption, increase bone strength, and protect the skeleton.

　　KEY WORDS: felodipine; bone histomorphology; rat; sclerotin metabolism; osteoporosis

　　近年来，中老年人因为钙丢失引起的骨质疏松已经引起人们广泛的重视，而许多老年人因合并心脑血管病，常需长期服用钙离子通道阻滞剂(calcium channel blocker, CCB)。CCB能选择性地阻滞钙离子经细胞膜上电压依赖性钙通道进人细胞内，减少胞内钙离子浓度，从而影响细胞的功能。钙离子是细胞整合、运动的第二信使，广泛影响体内的生理和病理过程。由于CCB的药理作用涉及钙代谢，因而必然影响骨钙代谢，临床广泛使用CCB对正常骨骼的影响以及导致骨质疏松的可能性已引起人们的关注。本研究探讨非洛地平灌胃对SD大鼠骨质代谢的作用，确定其对骨质疏松的影响，为临床用药提供直接的动物实验证据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 SD大鼠132只，6月龄，普通级，体重277～310g，平均286.4g，雌雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：陕医动证字2006105号。

　　1.2 药品及仪器 非洛地平片(2.5mg/片)，商品名：联环尔定，批号：20060302，江苏联环药业股份有限公司产品。病理图像分析仪：德国LEICA公司Q550CW全自动图像分析系统，由西安交通大学医学院实验中心共聚焦显微镜室提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组及给药 动物适应性喂养1周后，精确称重，按性别随机分为对照组、非洛地平高、中、低剂量组，每组33只。高、中、低剂量组的确定：按非洛地平成年人每天常用量5mg，用体表面积法计算出大鼠每天用量相当0.45mg/kg。据此，本实验把低于此剂量3倍的剂量(0.15mg/kg)作为低剂量，高于此剂量约3倍的剂量(1.25mg/kg)作为高剂量，而把0.45mg/kg作为中剂量。实验前将药研成粉末，用生理盐水配成所需浓度。正常对照组，每天给予生理盐水1mL灌胃; 低剂量组，每天给予非洛地平0.15mg/kg灌胃;中剂量组，每天给予非洛地平0.45mg/kg灌胃;高剂量组，每天灌胃给予非洛地平1.25mg/kg。每天灌胃时间固定，于上午8～10点进行，灌胃总剂量1mL。

　　1.3.2 骨组织形态计量学检测 分别在给予非洛地平灌胃3、4、5、6月后，在各组中按性别随机选取8只大鼠，共32只。颈椎脱臼法处死大鼠，立即剥取右侧股骨全长，剔除皮肤、肌肉，置于10%(体积分数)甲醛溶液中固定，混合脱钙液脱钙(3d)，待用手捏松质骨柔软有弹性时停止脱钙而脱酸，石蜡包埋，切片(片厚6μm)，HE染色。应用Q550C型全自动图像分析仪进行静态参数分析。指标如下：①平均骨小梁密度(MTPD，%)，视野中骨小梁面积占视野面积的百分比;②平均骨小梁间距(MTPS，μm)，相邻两个骨小梁之间的距离，每个视野测10个宽度，求平均值;③平均骨小梁厚度(MTPT，μm)，骨小梁自身的平均厚度，每个视野测10个宽度，求平均值;④骨小梁间连接点数(TB.n，个/mm2)，形成网状的骨小梁在单位面积内交叉连接点个数，每张片子测10个视野，求平均值;⑤骨小梁末端数 (FFT，个/mm2)，骨小梁因为某种原因而被吸收，留下两个残端，即单位面积内骨小梁游离残端个数，每张片子测10个视野，求平均值。

　　1.4 统计学处理 全部实验数据以±s表示，应用SPSS11.0统计软件进行处理。满足正态分布的变量，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY ANOVA)：若方差齐，组内比较采用LSD法(Least significant difference);若方差不齐，组内比较采用Tamhanes T2法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 形态学参数 实验3、4个月后，实验各组MTPD、MTPT、TB.n、MTPS、FFT无明显差异(P>0.05)，说明短期应用非洛地平，无论高、中、低剂量对股骨代谢都无影响(表1)。

　　实验5、6个月后，非洛地平中、高剂量组MTPD、MTPT、TB.n均明显低于正常对照组和低剂量组(P<0.05)，而MTPS、FFT均明显高于正常对照组和低剂量组(P<0.05)。说明随着用药时间的延长，中、高剂量非洛地平对股骨骨代谢产生了负面的影响，而低剂量非洛地平对股骨骨代谢无影响(表2)。实验6月后，非洛地平低剂量组MTPD、MTPT、TB.n均明显高于正常对照组(P<0.05)，而MTPS、FFT均明显低于正常对照组(P<0.05);非洛地平中、高剂量组MTPD、MTPT、TB.n均明显低于正常对照组(P<0.05)，而MTPS、FFT均明显高于正常对照组，高剂量组尤甚(P<0.05)。说明长期低剂量应用非洛地平对股骨骨代谢有正性作用，而长期中、高剂量应用非洛地平对股骨骨代谢可产生负面的影响，并且随剂量加大，对股骨骨代谢的负面影响越大。表1 实验3、4个月后各组大鼠股骨骨组织形态计量学的比较表2 实验5、6个月后各组大鼠股骨骨组织形态计量学的比较

　　2.2 股骨上端骨小梁在光镜下的分布和形态 实验3、4个月后各组大鼠股骨上端骨骺下2mm HE染色骨小梁结构未见明显差异，可见骨小梁结构完整，排列较紧密，连接呈网状，连接性可，骨小梁壁较厚，未见骨小梁盲端(图1A)。实验5月后各组大鼠股骨上端骨骺下2mm HE染色可见：非洛地平低剂量组与正常对照组骨小梁结构相似，可见骨小梁结构完整，排列较紧密，连接呈网状，连接性可，骨小梁壁较厚，未见骨小梁盲端(图1B);而非洛地平中、高剂量组骨小梁结构相似，骨小梁结构完整性稍差，排列较松散，连接性较差，骨小梁稍变细，可见骨小梁盲端(图1C)。实验6个月后各组大鼠股骨上端骨骺下2mm HE染色可见，正常对照组与3、4、5月正常对照组骨小梁结构相似，排列较紧密，连接呈网状，连接性可，骨小梁壁较厚，未见骨小梁盲端;非洛地平低剂量组骨小梁结构完整，排列更紧密，连接呈网状，连接性好，骨小梁壁明显增厚，无骨小梁盲端(图1D);非洛地平中剂量组可见，骨小梁结构完整性尚可，排列较松散，连接性较差，骨小梁变细，稀疏，骨小梁盲端较多(图1E);非洛地平高剂量组骨小梁结构完整性破坏，排列稀疏，骨小梁壁变窄，中断，间距增大，数量较少，骨小梁盲端明显增多，呈松散状态(图1F)。

　　3 讨 论

　　3.1 关于实验动物的选择 SD大鼠是目前研究骨质疏松和骨质代谢中使用最多、最成熟的实验动物[14]。康毅等[5]观察4～7月龄SD雌性大鼠的骨量、骨形成和骨吸收的变化，结合骨形态计量学静态和动态参数，发现在4～7月龄之间，随大鼠月龄增加，骨形成和骨吸收的活跃程度降低，但仍保持相对平衡状态，使骨量基本不变;到10个月时达到峰值骨量;12个月以后一般被认为已进入老龄;21个月以后，由于雌激素缺乏，雌性大鼠乳腺肿瘤发病率上升，已不适合做骨代谢研究。本实验选用6月龄SD大鼠(雌雄各半)作为研究对象，原因有三：①大鼠血压、血管阻力和骨质代谢对药物反应敏感;②非洛地平在人群中广泛应用，无明显性别差异性，为了消除性别对实验的影响，故选用雌雄各半大鼠进行实验;③选用6月龄大鼠是因为6～12月SD大鼠正处于中年期，骨质代谢活跃，并相对稳定;并且此时的大鼠体格强壮，不易生病，便于饲养。实验结果表明，不同剂量、不同时间应用非洛地平对大鼠骨质代谢的影响较明显，提示选用的实验动物可靠。

　　3.2 非洛地平对SD大鼠骨质代谢的干预作用 CCB是选择性地阻滞钙离子经钙通道进入细胞内，从而使细胞内钙离子浓度降低的一类药物。非洛地平(felodipine)为二氢吡啶类(DHPs)钙拮抗剂，化学名称：2,6二甲基4(2,3二氯苯基)1,4二氢3,5吡啶二甲酸甲乙酯，由瑞典Astra公司开发，1988年首先在瑞典丹麦上市，1996年进入我国。非洛地平口服后迅速吸收分布，达峰时间为1～2h，其半衰期长达16～25h，血浆蛋白结合率为99%，生物利用度15%～20%。非洛地平存在首过效应，全部代谢物无药理活性，食物不影响其药动学性质，75%随尿液排泄，25%由粪便排出体外。非洛地平对血管具有极高的选择性，临床上广泛应用于高血压和心绞痛的治疗[69]。由于钙拮抗剂的药理作用均涉及钙生理和钙代谢问题，因而必然影响骨钙代谢和骨折愈合过程。

　　3.3 非洛地平对SD大鼠股骨骨组织形态计量学指标的影响 骨形态计量学属体视学、生物医学组织形态计量学中的一个分支[5]。它是定量地评价骨形成与吸收的客观方法，能充分说明药物的效果，可作为衡量药物治疗骨质疏松症的必要客观指标。大鼠的骨重建周期为30～40d。本实验给予6月龄大鼠不同剂量非洛地平灌胃，最短时间为90d，最长为180d，以保证实验结果的可靠性。本实验由于条件所限，只检测了大鼠股骨上端的一些形态计量学静态指标：MTPD、MTPT、TB.n、MTPS、FFT。实验结果表明，长期中、高剂量应用非洛地平引起了大鼠骨显微结构较大的改变，使大面积的骨吸收从骨小梁的表面逐层降解骨胶原，破坏其连续性，骨小梁变细变薄，骨质稀松，骨丢失显著，在高剂量时表现得更甚。可以推测骨的这些力学结构变化会影响骨的力学性能，降低强度，加大骨折的危险性。以上股骨骨组织形态计量学检查结果与股骨骨密度检查结果一致，进一步证实了非洛地平对股骨骨质代谢的影响。

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