有机镓对维甲酸致骨质疏松大鼠骨骼中微量元素的影响

　　作者：赵俊杰，雷艳霞，李广元，赵晶，张丹英，耿 东 作者单位：西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 对比研究有机镓与无机镓对维甲酸引起的骨质疏松模型大鼠骨骼骨矿和微量元素含量的影响。方法 维甲酸按85mg/(kg·d)灌胃15d，建立大鼠骨质疏松模型，经有机镓、氯化镓灌胃给药治疗4周后，采用生化、病理等方法测定骨代谢相关指标，原子吸收法测定血、股骨、牙齿中钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Ze)锰(Mn)元素含量并比较其治疗效果。结果 与对照组相比，维甲酸可引起大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(AKP)明显升高及骨结构类骨质疏松症样改变;骨质疏松模型大鼠血清Ga、Fe、Mn、P、Ca、Zn、Mg含量均未见明显差异，股骨中Ga、Fe、Mn、P、Ca含量和牙齿Ga、P、Ca含量均明显降低。应用氯化镓、有机镓治疗，可明显降低骨质疏松模型大鼠TRAP和AKP活性，改善骨密度及骨形态计量学参数，增加股骨和牙齿中Ga、Fe、Mn、P、Ca元素含量，其中以有机镓效果最明显。结论 在动物实验中，镓盐能通过降低骨转换率，阻止骨钙释放,增加骨钙、磷含量,直接作用于骨形成而改善骨质疏松,有机镓较无机镓更安全、有效。

　　【关键词】 有机镓 镓盐 维甲酸 骨质疏松 骨代谢 大鼠

　　Influence of organicgallium on trace elementsin rat bone of osteoporosis caused by tretinoin

　　ZHAO Junjie, LEI Yanxia, LI Guangyuan, ZHAO Jing, ZHANG Danying, GENG Dong

　　Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases, Ministry of Education,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To study the influence of organicgallium and gallium chloride on rat bone trace element metabolism in osteoporosis caused by tretinoin. Methods Osteoporosis model of rats was induced by intragastric administration of tretinoin at the dose of 85mg/(kg·d) for 15 days, and then they were randomly divided into control, organicgallium and gallium chloride treatment groups. Four weeks after treatment, the changes of osteoporosis indices were observed by biochemical and pathological approaches. Results Tretinoin could cause significant increase of tartrateresistant acid phosphatase (TRAP) and alkaline phosphatase (AKP), and could also induce the changes of rat bone structure, which indicated the appearance of osteoporosis. Compared to those in the control group, the contents of Ga, Fe, Mn, P, Ca, Zn and Mg in serum had no significant differences, but the contents of Ga, Fe, Mn, P and Ca in femur and Ga, P and Ca in teeth were decreased significantly. Four weeks after organicgallium and gallium chloride therapy, bone density, thickness of bone cortex and the percentage of bone trabecula were increased; so were the contents of Ga, Fe, Mn, Ca and P in femur and teeth. However, the activities of TRAP and AKP were decreased. Conclusion Conversion rate of bone was declined, thus preventing bone calcium release and improving osteoporosis. In comparison, organicgallium is not only less dose needed and safer for animals but also better in therapeutic effects.

　　KEY WORDS: organicgallium; gallium chloride; tretinoin; osteoporosis; bone metabolism; rat

　　骨质疏松症是老年人常见的骨病之一，严重影响老年人的身体健康和生活质量。近年的研究表明，骨质疏松与某些矿物质摄取不足、过量或不平衡有关[12]。近年来，我们开展了镓盐对骨质疏松治疗作用的研究，发现镓盐具有抑制破骨细胞活性、降低骨转化率、抑制骨溶解、阻止骨钙释放的功能。考虑到一般无机元素对消化道吸收影响较大，亦有一定的毒副作用，故本研究采用生物转化技术，用合适镓溶液孵育绿豆芽，将无机镓转化为有机镓，应用于维甲酸致大鼠骨质疏松模型的治疗研究，观察氯化镓与有机镓对维甲酸引起的骨质疏松模型大鼠骨骼骨矿物质和微量元素含量的影响以及治疗作用，为骨质疏松的防治提供重要的实验资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的建立

　　3月龄雌性SD大鼠50只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(国家A级动物中心)，体重190～260g，随机分为正常对照组(13只)和骨质疏松组(37只)。骨质疏松组大鼠均按85mg/(kg·d)维甲酸灌胃15d，对照组用蒸馏水，两组均以常规饲料喂养和饮用蒸馏水。15d后，每组随机选5只大鼠处死，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(BGP)等血清学指标检测及骨组织病理形态计量学测定，观察模型复制情况。然后进入治疗阶段。动物分为正常对照组、骨质疏松组、氯化镓治疗组、有机镓治疗组，每组8只。氯化镓治疗组采用60mg/(kg·d)GaCl3灌胃;有机镓治疗组应用镓溶液培育绿豆芽提取液(含镓12mg/L)10mL/(kg·d)灌胃。治疗4周后，乙醚麻醉，抽血，处死取材。剥取右股骨及牙颌骨，煮沸去净软组织，低温烘干待用。

　　1.2 检测指标及方法

　　1.2.1 骨病理形态计量学测定

　　取大鼠下肢骨常规脱钙制片，用MIAS型北航多功能病理彩色图像分析系统检测，计算平均骨小梁宽度、平均骨小梁间距、平均骨皮质厚度及骨容积占骨髓质容积百分比(以骨小梁百分比表示)。

　　1.2.2 TRAP、AKP及BGP的测定

　　TRAP采用硝基酚磷酸盐比色法测定;血中总AKP应用分光光度法检测,试剂盒由南京建成生物研究所提供;BGP用放射免疫法测定。

　　1.2.3 镓、铜、锌、铁、钙、镁、钾元素的测定

　　血清和骨骼中镓、铜、锌、铁、钙、镁、钾等元素用原子吸收分光光度计测定。股骨和牙齿样本经低温烘干、称重，放聚四氟乙烯消化釜内，加浓硝酸1mL、H2O2 3mL旋紧外层不锈钢外壳盖，120℃消化约3h，冷却，定容待测。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS for Windows 10.0软件进行统计分析。实验数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较行t检验和方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 模型期检测结果

　　2.1.1 血清微量元素及AKP、TRAP活性

　　与对照组相比，骨质疏松组血清AKP和TRAP活性明显升高(P<0.01)，BGP含量明显降低(P<0.01)，血清Ga、Ze、Fe、P、Ca含量组间比较均未见明显差异(表1)。表1 模型期大鼠血清学指标的检测结果(略)

　　2.1.2 骨组织形态计量学

　　与对照组相比，骨质疏松组平均骨小梁宽度变窄,平均骨小梁间距变大,平均骨皮质厚度变薄(P均<0.01)，骨小梁百分比降低(表2)。表2 模型期大鼠骨组织形态计量学结果(略)

　　2.2 治疗后检测结果

　　2.2.1 血清微量元素及AKP、TRAP活性

　　应用氯化镓和有机镓治疗4周后，与对照组相比，骨质疏松组大鼠血清AKP、TRAP活性仍处于较高水平，BGP含量仍处于较低水平;而治疗组血清AKP、TRAP活性明显降低(P<0.01，P<0.05)，BGP含量显著上升(P<0.05)，血清Ga含量明显升高(P<0.01)，血清其他元素各组间未见明显差异(表3)。表3 治疗后血清学指标的检测结果(略)

　　2.2.2 骨组织形态计量学

　　骨形态计量结果表明，与骨质疏松组相比各治疗组平均骨小梁宽度明显增宽，平均骨皮质厚度明显变厚，骨小梁百分比明显升高，平均骨小梁间距明显缩小，且有机镓组治疗效果更明显(表4)。表4 治疗后大鼠骨组织形态计量学结果(略)

　　2.2.3 股骨、牙齿矿物质与微量元素

　　与对照组相比，骨质疏松大鼠股骨Ga、Fe、Mn、P、Ca含量均明显降低(P<0.01，P<0.05)，牙齿Ga、P、Ca含量亦显著降低(P<0.05)。采用无机镓盐和有机镓治疗后，各治疗组大鼠股骨Ga、Fe、Mn、P、Ca和牙齿镓Ga、P、Ca明显升高(P<0.01，P<0.05)，其中镓豆芽治疗组效果更为明显(表5、表6)。表5 治疗后大鼠股骨微量元素含量的比较(略)表6 治疗后大鼠牙齿微量元素含量的比较(略)

　　3 讨 论

　　骨质疏松症是当代老年人尤其是老年女性的多发病、常见病，临床表现为单位体积骨组织的骨基质和骨矿物质等比例减少。骨矿物质主要由无定形的Ca、P混合物和结晶Ca、P羟基磷灰石构成。Zn、Mg、Fe、Mn、Cu、B等多种微量元素既是形成骨矿，促进骨生长，维护骨细胞结构与功能的重要组成部分，同时又作为许多骨代谢酶的组成部分或活性中心，在体内催化一系列成骨的化学反应，影响着软骨和骨骼形成所需的胶原和糖蛋白合成等生物学效应，直接或间接影响钙平衡与骨代谢。这些元素的的缺乏可能是老年骨质疏松症发生、发展的一个重要因素。

　　镓是人体内非必需微量元素。自WARRELL等[3]报道了硝酸镓能抑制骨再吸收和对于癌症有关的高钙血症有效的结果之后，镓作为一种新的治疗代谢性骨病的药物，其对骨质疏松的治疗作用以及对骨钙的调节作用引起了人们极大的关注。近年我们对镓盐与骨质疏松进行的体内或体外研究结果表明，镓既能抑制骨的再吸收，快速抑制骨代谢异常的转化率，也能增加骨中钙和磷的含量，直接作用于骨形成[46]。考虑到硝酸镓注射液对肾脏和肝脏有极大的毒性，限制了其有效剂量的应用和推广使用，而氯化镓口服液毒性较小，但胃肠吸收较差，故本研究采用生物转化技术，用合适的镓溶液孵育绿豆芽，将无机镓通过生物转化为有机镓，同时对比观察无机镓和有机镓对维甲酸致骨质疏松大鼠的治疗作用以及在骨代谢过程中微量元素的变化。结果表明，应用维甲酸对3月龄雌性大鼠灌胃两周后,可使模型大鼠血清AKP、TRAP活性明显升高, 引起平均骨小梁宽度和平均骨皮质厚度明显变小，骨小梁百分比明显降低等类骨质疏松样变化。应用无机镓和有机镓治疗4周后，各治疗组大鼠血中AKP、TRAP活性降低，BGP含量升高;平均骨皮质厚度增加，骨小梁百分比变大。提示镓有拮抗骨吸收,促进骨形成，降低骨转换作用，相比较而言，有机镓效果更佳。

　　BOCKMAN等[7]应用同步加速器产生的X线显微检查微技术(XRM)，研究镓在骨中的定位及其对其他元素的影响时发现，镓优先聚积在骨细胞代谢和骨基质转换的活跃区，使骨中天然存在的微量元素浓度和分布发生改变。这一研究提供了镓在骨中生物学作用的可能机制。在本研究中，骨质疏松大鼠血清中诸元素与对照组相比均无明显差异;而骨中微量元素测定结果显示，骨质疏松大鼠股骨Ga、Ca、Mn、P、Fe和牙齿Ga、Mn、Ca、Fe元素含量明显降低，表明维甲酸可引起骨矿物质Ca、P和微量元素Ga、Mn、Fe丢失,进而导致其他有机质及无机质的相继丢失,造成骨质疏松症。骨质疏松与元素Ga、Ca、Mn、P、Fe密切相关。经氯化镓和有机镓治疗后，治疗组大鼠血清Ga含量明显升高,其他元素末见明显改变,这与以往研究结果一致[8]。而股骨和牙齿中Ga、Fe、Mn、P、Ca元素含量明显升高，尤以有机镓治疗效果更为显著，与BOCKMAN[910]等的镓可直接抑制骨溶解,阻止骨钙释放，增加骨钙、磷含量,直接作用于骨形成的结果一致。相比较而言，有机镓不仅用量少，而且在抑制骨溶解、增加骨钙、磷和微量元素含量诸方面都明显优于氯化镓。其原因可能是通过生物转化将无机镓转化为有机镓形式更易于骨的吸收、利用，抑或是有机镓中含有某些氨基酸、蛋白质、维生素等物质可促进镓的吸收、利用。

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