SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

　　作者：袁亚江 ， 梅晰凡，高蔚然，张赫 作者单位：(1.辽宁医学院附属第一医院骨科;2.辽宁医学院附属第一医院肿瘤科，辽宁 锦州 121001)

　　【摘要】 目的 建立大鼠肋软骨细胞(RCC)分离、培养的方法, 探讨其传代过程中细胞外基质及其形态的变化。方法采用胰酶和II型胶原酶两步消化法结合机械吹打获得分散的单个RCC，观察单层培养的不同代数RCC的细胞形态变化;采用免疫细胞化学方法检测不同代数RCC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。结果 大鼠肋软骨经两步消化后，可获得高纯度的软骨细胞，经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性结果，同时观察到RCC在传代过程中细胞发生了去分化现象。结论 软骨细胞可以通过传代培养获得扩增，但仅限于四代以内细胞。

　　【关键词】 大鼠;软骨细胞;单层培养;去分化

　　The Culturing of SD Rat Costochondral Chondrocyte and Observation of DedifferentiationYUAN Yajiang1, MEI Xifan1, GAO Weiran2 , ZHANG He

　　(1.Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University

　　2.Cancer Tumour, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract: Objective To establish the separating and culturing methods for rat costochondral chondrocyte (RCC), and to investigate their morphous changes in the course of cell passage.Methods Under the help of collagenase II and trypsins digestion, the scattered single RCC was obtained. The observation of morphological changes of RCC cells cultured by monolayer culture in different generations was carried out. And the detection of the expression of collagen II and proteoglycan of RCC cells in different generations by immunocytochemical method was also implemented. Results High purity cartilage cells were obtained from rat costal cartilages after digested by collagenase II and trypsin. It was confirmed by immunohistochemistry and toluidine blue staining. The dedifferentiation of RCC cells was observed when the RCC cells were cultured by monolayer culture.Conclusions RCC cells can be amplified by passage Culture,but only within the cells of four generations.

　　Key words:rat; cartilage cell; monolayer culture; dedifferentiation

　　关节软骨损伤后，因局部血供缺乏，所以多年来一直被认为软骨细胞本身不具有修复与再生能力。1989年Webber[1]的研究结果却显示:软骨细胞能进行自我修复，只是它们的修复能力在体内环境中不能得到激发。

　　自20世纪80年代以来，人们对关节软骨的再造和修复研究的焦点已转向细胞疗法(cell-based therapy )，即移植足够数量的软骨细胞来修复关节软骨的缺损。Yanchun Liu等[2]偿试应用自体关节软骨细胞为种子细胞，以聚轻基乙酸(polyglycolic acid, PGA )及Pluronic为支架材料，对猪膝关节全厚软骨缺损(直径8 mm)进行修复，在24周时取得了最佳修复效果。修复的缺损表面光滑，与周围正常软骨无法区分，新生软骨在组织学、生化组成上与正常关节软骨非常接近，最大抗压能力达到了正常关节软骨的60%以上。

　　本实验拟为软骨种子工程种子软骨细胞的优化获取提供一种有效的可行方法，并探讨其分化能力及分化后的生物学性状。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 II型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，标准胎牛血清(Gibco公司)，高糖DMEM培基(Gibco公司);青霉素及链霉素(新华制药公司)CO2恒温培养箱(HERA Cell);兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(mAb)、PV两步法免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物有限公司)。

　　1.2 软骨细胞的采集 选用新生3～5 天的SD大鼠乳鼠1 只，浸入75%的医用酒精中，5 min×3 次，处死并消毒;无菌条件下取大鼠肋软骨，用PBS(含青、链霉素各100 U/mL)冲洗2 次，剔除软骨表面肌肉、骨膜及纤维组织，将软骨用眼科剪至1 mm×1 mm的碎块，加入3倍体积的0.25%的胰酶37℃消化半小时，中间吹打1 次，弃掉胰酶后加入同胰酶相同体积的DMEM(含15%胎牛血清)终止消化，然后800 r/min离心5 min，弃上清加2倍体积的0.1%II型胶原酶消化4 h，前3小时间每一小时晃动培养皿1 次，观察大部分软骨块消化后，15 min吹打1 次，提取消化细胞悬液镜下观察细胞量足够多后经200目金属筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，去上清，再用培养基洗2 次，用加入5 mL完全培养基(含15%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)重新悬浮细胞，将细胞接种于25 mL的培养瓶中培养，标记为C1，留取部分悬液行台盼蓝染色计数并检测活细胞比例。

　　1.3 软骨细胞单层培养及生物学特性动态观察

　　按2×104 细胞/cm2 的密度接种, 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24 h 后更换培养液(含10%小牛血清), 以后培养基每2 d更换1 次。当软骨细胞达到85%融合后以0.25%胰蛋白酶消化传代。再次接种密度仍为2×104 细胞/cm2,传代培养条件与原代培养相同，并依次标记为C2……C6。倒置显微镜下观察每一代细胞的生长、形态变化、细胞活力、分化融合的生物学特性形态并拍照记录。取生长状态良好的原代细胞进行生长状态观察，用0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个/孔接种于24 孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共8日根据记数结果绘制细胞生长曲线。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘在坐标纸上，得到生长曲线。

　　1.4 甲苯胺蓝染色 将0.5 g甲苯胺蓝溶于100 mL PBS中配成0.5%甲苯胺蓝溶液，将爬满软骨细胞的玻片用10%福尔马林固定1 h，自来水冲洗15 min，蒸馏水冲洗1次，甲苯胺蓝染色2～4 h，75%乙醇冲洗1 次，90%乙醇冲洗1次，95%乙醇冲洗1 次，光镜下观察照相。

　　1.5 II型胶原免疫组织化学染色 将原代软骨细胞接种于6孔板中的盖玻片， 95%乙醇固定15 min，PBS洗涤，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2 次;加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加兔抗鼠一抗(1:100)，37 ℃孵育2 h;PBS洗5 min，3 次;行SABC免疫细胞化学染色。直接参照SABC试剂盒操作方法进行显色。

　　2 结 果

　　2.1 新生SD大鼠肋软骨原代细胞培养和形态学观察 刚接种的原代软骨细胞倒置显微镜下观察大多成圆球形悬浮于培养液中;接种8 h 后大多数细胞呈圆形贴壁状态并开始展开(图1A);24 h 后细胞扁平且透亮，边缘出现突起，可见伪足伸出，细胞形态为多角形、星形、圆形，胞质颜色较深，胞核为圆形。细胞在培养3天以后增值迅速，6 d 以后细胞铺满瓶底, 呈“铺路石”状, 同时还有相当多保持圆形的细胞(图1B)，部分地方出现分层生长 。细胞达到80%融合，必须进行传代。各代细胞胎盘蓝染色测定细胞活力均达到97%以上。

　　2.2 软骨细胞传代培养和形态学观察 传代后的软骨细胞贴壁较快，刚传代的细胞为圆形，折光性好，接种后一般在2～4 h细胞迅速贴壁、伸展，漂浮的细胞较原代培养明显减少，3～4天细胞即可铺满瓶底。随着传代次数的增加，软骨细胞明显梭形变，C3可见部分细胞呈三角形(图2A)，含少量的梭形细胞，传代到C4，明显的不规则形细胞增多，C6可见细胞基本呈不规则形(图2B)。

　　2.3 生长曲线的绘制 软骨细胞的生长曲线基本呈“S”形，经传代后细胞生长开始增快，C3软骨细胞增殖最为迅速，一般在接种后1～3天细胞增殖较缓慢，3～7天呈指数生长，7～8天进入平台期。

　　2.4 甲苯胺蓝染色 取C1和C4细胞爬片行甲苯胺蓝染色对比，可见C1蓝染细胞达到98%之多，而且颜色较深。而C4细胞可见少量细胞显色，但较C1细胞浅很多，而且细胞形态也较小(图4A、4B)。表1 软骨细胞生长曲线

　　2.5 II型胶原免疫组织化学染色 C1细胞在II型胶原免疫组织化学染色后，荧光显微镜下观察可见细胞发出较强的绿色荧光，而且分布均匀，和C4细胞做对比，则C4细胞的荧光强度明显降低，而且细胞形态也呈梭形(图5A、5B)。

　　3 讨 论

　　软骨细胞外基质由胶原和蛋白聚糖组成，其中胶原占软骨干重的50%～70%，蛋白聚糖占20%～40%，结构糖蛋白占5%～15%。胶原主要由II型组成，其他还含有，它们形成一个网络结构，使软骨具有特殊的应力和形态，对杭高度亲水的蛋白聚糖产生的肿胀压。本实验采用胰蛋白酶和II型胶原酶两步消化法。先采用胰蛋白酶的主要作用是使细胞间质的蛋白质水解，但不宜浓度太大和时间太长，否则也会损伤细胞。II型胶原酶的主要目的则是分解开细胞间II型胶原产生的应力，但由于少量的V型、VI型、IX型、X型和XI型胶原的存在，不能完全用酶将细胞分离开，所以后期需要频繁地进行吹打，其目的是为了使细胞充分地离散。使用该方法获得的细胞行台盼蓝染色后显示，其分离出来的软骨细胞活性达到97%，完全可以作为实验细胞使用。

　　软骨细胞具有高分化特性，但普通单层贴壁培养的软骨细胞在体外其表型难以维持，软骨细胞将会发生一系列的变化:包括形态、表型及相关基因的表达，这过程一般被称为软骨细胞的去分化(Dedifferentiation)现象[3]。

　　本实验在软骨细胞的通过软骨细胞单层培养过程中观察到，在传代过程中细胞的形态逐渐发生了变化，原代的软骨细胞贴壁后在倒置显微镜下细胞多呈多角形、星形、圆形，胞质颜色较深，胞核为圆形，细胞饱满而大。传代至第四代倒置显微镜下观察发现细胞开始呈现不规则形，多数形态表现为近似于细长梭形。第五代梭形变的细胞达到80%。从细胞的形态特征看，软骨细胞梭形变是判断软骨细胞表型是否改变的主要指标[4]。

　　试验中也同时从细胞的功能上对软骨细胞传代前后进行了分析，主要通过蛋白多糖和II型胶原的检测来观察。原代软骨细胞的甲苯胺蓝染色呈强阳性，且分布均匀，而相同处理后的第四代软骨细胞则出现阴性结果，虽然部分细胞继续有阳性表达，但也是较弱的表达。从而说明传代次数可以使软骨细胞的蛋白多糖分泌明显减少，四代以后尤为明显。II型胶原是软骨的主要胶原，主要由软骨细胞分泌，本实验通过软骨细胞II型胶原的免疫组织化学检测对原代及传代细胞进行了分析，C1细胞荧光显微镜下发出较强的绿色荧光，呈强阳性; C4也可见部分细胞出现绿色荧光，但很弱，且细胞形态多呈不规则形。说明C1细胞的II型胶原分泌较旺盛，而传至第四代的软骨细胞II型胶原分泌明显减少。由于失去了细胞外基质对软骨细胞的作用，经多次传代，软骨细胞即从多角形演变为成纤维细胞样的外观。细胞外基质逐渐减少，胶原的类型发生改变，最终导致软骨细胞的特有表型丧失[5-8]。从分子水平上细胞内II型胶原、蛋白多糖的mRNA减少;从细胞功能上，细胞合成和分泌的II型胶原、蛋白多糖在减少，而I型胶原在增加，都可以说明软骨细胞己具有成纤维细胞的特征，而不具有或较少具有软骨细胞特征[9]。

　　Meyer和Chatterjee[10]于1978年提出了软骨移植成功的4个条件:(1)软骨细胞保持生存;(2)保持活力并持续产生胶原和蛋白多糖;(3)骨软骨片与宿主骨牢固连接;(4)能抵抗宿主的免疫作用。至今仍适用。本人通过实验认为软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞修复软骨缺损，但要想使软骨细胞在体外更长时间地保持其某些特性，则需要模拟软骨的体内环境进行培养。因为软骨细胞正是在单层培养失分化过程中获得增殖能力[11]，所以在需要大量的软骨细胞进行移植的话，通过软骨细胞的体外扩增是不可取的，这样就需要更容易获得并扩增的其它种子细胞进行诱导移植。

　　【参考文献】

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　　[10] Meyers M H, Chatterjee SN. Osteochondral Transplantation[J]. Surg Clin North Am, 1978, 58 (2): 429-434.

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