新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定

　　作者：张正，刘丹平，陈峻江，郭韬，张男 作者单位：(辽宁医学院附属第一医院骨科，辽宁 锦州 121000)

　　【摘要】 目的 构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法 将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1。携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌，利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用PacⅠ酶切去除其质粒成分，暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列，转染293细胞，进行腺病毒的包装，完成新型腺病毒载体Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建。作为阳性对照，同时制备多年来广为应用的 BMP2腺病毒表达载体Ad CMV-BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞，通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用 。结果 突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后，新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2。结论 成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。

　　【关键词】 骨形态发生蛋白2基因;绿色荧光蛋白;腺病毒载体;同源重组;成骨诱导

　　Construction and Identification of a Novel Expressing BMP2

　　Recombinant Adenovirus VectorZHANG Zheng, LIU Danping, CHEN Junjiang, GUO Tao, ZHANG Nan

　　(Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000 China)Abstract: Objective To construct a novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein(GFP) as a reporter on the same transcript. Methods The basic pairs of BMP2 behind the translation stopping codon TAG were removed and a XhoⅠrestriction site was added following the end of the mutant. Then, the mutant of BMP2 gene (BMP2+ gene)was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1 by means of the directional cloning technology. Once tested by restriction digestion, the shuttle plasmid was linearized with Pme I and transformed into BJ5183-AD-1 cells to recombine the genes of BMP2+ and GFP together with their cis-acting elements into adenoviral plasmid through a new simplified bacterial homologous recombinant method. To expose its inversted terminal repeats, the recombinant adenoviral plasmids were digested with PacⅠ, and were then used to 293 transfected cells to generate the desired recombinant adenoviruses, Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1. After the resultant viruses infected the bone marrow stromal cells (MSCs), the expression of BMP-2 gene was verified by RT-PCR, the osteoinduction activity of the expressed BMP2 was confirmed by alkaline phosphatase activity assay, and the expression of GFP gene was tested through fluorescence microscope. As a positive contrast, another recombinant adenovirus, AdCMV-BMP2, which has been used extensively since many years ago, was also constructed.Results Either the sequence of BMP2 gene mutant or the restriction maps of the recombinant adenoviral shuttle plasmids and the recombinant adenoviral plasmids accorded with experimental project beforehand. The new recombinant adenovirus vectors could express both the gene of BMP2 and GFP at the same time. The expressed BMP2 had osteoinduction activity. Conclusions A novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein as a reporter on the same transcript were successfully constructed.

　　Key words: bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene; green fluorescent protein (GFP); adenovirus vector; homologous recombination; osteoinduction

　　重组腺病毒在基因治疗中被作为一种高效基因转移和表达载体，广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞[1]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP-2)是一种重要的成骨诱导分化细胞因子，可诱导具有成骨分化潜能的间充质细胞向成骨细胞分化，在骨的发生、发育、修复和再生过程中发挥十分关键的作用。BMP-2转基因诱导成骨可实现一定时间内的BMP-2持续表达，近十年来受到广泛关注。迄今为止，病毒型和非病毒型BMP-2表达载体都已被用于BMP-2基因转移诱导成骨研究，其中BMP-2腺病毒表达载体(BMP2-expressing recombinant adenoviral vector,Adv-BMP2)介导的BMP-2转基因方法被认为是其中最有效的手段[2]。为了方便基因的表达检测，我们利用了一种新型的腺病毒载体构建系统，使BMP2基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因同时表达，并且通过对BMP2基因的突变，将FLAG抗原标记附加于BMP2，构建了一种新型的BMP2腺病毒表达载体。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　限制性内切酶:NotⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ;高保真DNA聚合酶(TaKaRa PyrobestTMDNA Polymerase);大肠杆菌来源的碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatases ,BAP);dNTP;T4DNA连接酶(T4DNA Ligase);DNA凝胶回收试剂盒;RT-PCR试剂盒和DNA Marker：DL1500、DL2000、λHandⅢdigest等购于宝生物工程(大连)有限公司。限制性内切酶PmeⅠ、Pac I购于纽英伦(北京)生物技术有限公司。PCR提纯试剂盒(PCR Purification Kit)， 磷酸钙转染试剂盒(MBS Mammalian Transfection Kit)为美国Stratagene公司产品。超纯质粒提纯试剂盒(MobiusTM 1000 Plasmid Kit )为德国Novagene公司产品。ALP检测试剂盒(Alkaline/Acid Phosphatase Assay Kit)购于美国upstate公司。

　　1.2 质粒和菌株

　　pcDNA3-BMP2由第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，BMP2基因cDNA位于多克隆位点NotⅠ、XhoⅠ位点之间，后者在基因连入过程中已经被破坏。

　　pcDNA3-BMP2+(BMP2+代表携带去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因)、腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1及pShuttle CMV- BMP2均由我们自己构建和保存[3]。

　　BJ5183-AD-1大肠杆菌为Stratagene公司产品。

　　1.3 细胞及细胞系

　　人胚肾293细胞系为American Type Culture Collection( ATCC)产品。

　　骨髓基质细胞由本院外科实验室培养、保存。

　　1.4 细菌内同源重组构建腺病毒质粒

　　将含有pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1质粒和pShuttle CMV-BMP2质粒的菌株分别化线接种于LB-Kanamycin Agar,37 ℃倒置培养过夜;次日挑选单克隆,分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养;第二日上午用碱裂解法抽提质粒抽提质粒， Pme Ⅰ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳验证，确保穿梭质粒已经被Pme Ⅰ酶切线性化。乙醇精制以上酶切反应体系，重新溶解于ddH2O中，使终浓度为50～100 ng /μL，备用。电穿孔仪设置在200 Ω, 2.5 KV, 25 μF条件下。冰上预冷0.2 cm gap电击杯、电击池和2只微量离心管。冰上解冻BJ5183-AD-1电感受态细胞。于2只微量离心管中各加入40 μL电感受态细胞胞，分别加入1 μL Pme Ⅰ酶切线性化的pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1和pShuttle CMV-BMP2,混合均匀后加入2支0.2 cm gap电击杯。将电击杯置于电击池内，送入电穿孔仪分别电击。电击后迅速向每只电击杯中加入500 μL的LB-Broth，吸打混均，接种于LB-Kanamycin Agar,37 ℃倒置培养过夜。次日挑选10个单克隆，分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养。取5 mL过夜培养物抽提质粒， Pac Ⅰ酶切，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳鉴定，筛选重组成功的阳性克隆。剩余的4mL置于4 ℃冰箱保存。将保存的4 mL阳性细菌克隆液体培养物接种于250 mL LB-Kanamycin Broth，大量扩增、用超纯质粒提纯试剂盒抽提pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP2。

　　1.5 腺病毒载体包装

　　PacⅠ酶切pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP20.8%琼脂糖凝胶电泳验证，确保酶切完全后，以PCR反应提纯试剂盒精致酶切反应液，以去除酶和缓冲液，并将DNA(腺病毒基因组)重溶于灭菌ddH2O ，使终浓度为5 μg/225 μL ，-20℃保存备用。

　　常规复苏和传代培养293细胞，转染前24 h在2支直径6 cm培养皿内分别植入(7～8) × 105细胞，加 4 mL含10胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃，5% CO2 条件下过夜培养至70%汇合。

　　以5 μg DNA/只培养皿比例，将上述制备的两种腺病毒基因组DNA及转染试剂按照商家说明分别加入细胞培养皿中，37 ℃，5% CO2温育10 h，用磷酸钙法将腺病毒基因组DNA转染于293细胞。继续培养7～10日，必要时换液，待出现明显细胞病变现象后收集细胞，反复冻-融三次裂解细胞，离心收集病毒并测定病毒滴度，完成腺病毒载体的包装。

　　1.6 BMP2和GFP表达检测

　　将MSC细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，常规培养24 h细胞贴壁后，吸弃上清。随机选取2 孔感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1 ，另取2 孔感染Ad CMV-BMP2作为阳性对照，感染复数(MOI)均为50，留下2孔作为阴性对照。37 ℃ 孵育1 h，换成DMEM+10%胎牛血清培养基，在体积分数为5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下继续培养72 h,荧光显微镜下检测GFP,然后按商家产品说明,用RNA提纯试剂盒抽提细胞总mRNA。置于-80 ℃冰箱保存待用。

　　取3 种RNA 各约80 ng加入3 支反应管内，以8.5 μL去RNA酶ddH2O稀释，75 ℃变性5 min，冰上冷却。按商家说明建立反应体系，反转录BMP2基因cDNA第一链。反应结束后冰上冷却5 min备用。

　　设计合成BMP2基因cDNA特异引物： 5′-CGTGACTCTGTCTTCTAG-′3 ;5/-GCACACTCGAGGCGACAC-′3。PCR扩增BMP2 cDNA，取10 μL在以1%琼脂糖凝胶电泳检测。BMP2基因在三组细胞内的mRNA 表达情况。

　　1.7 碱性磷酸酶活性检测

　　将第二代MSC细胞以1×103/孔的密度接种于96 孔板，在完全培养基内， 5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h。随机选取32孔作为实验组(感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1， MOI=50);另选32孔作为阳性对照组(感染Ad CMV-BMP2， MOI=50);其余32孔作为阴性对照组(不予感染腺病毒载体)。37 ℃ 孵育1 h，小心吸除个孔内的液体，用PBS清洗实验组和阳性对照组各孔两次，然后用完全培养基继续在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养各组细胞。分别于感染载体后第6、8、10、12日收集各组细胞，每次各组均收集8孔，调整各孔细胞浓度为1×105cells/mL,各取1 mL用于ALP活性检测。绘制ALP活性曲线;对三组细胞6、8、10、12日4个时间点的ALP活性采用发样本均数两两比较q检验，进行统计学分析，以P<0.05的差异具有显著性。

　　1.8 采用重复测量的方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 腺病毒质粒的构建 见图1、2。

　　2.2 ALP活性检测结果 见表1。表1 不同时间3 组细胞间ALP活性比较注：三组比较F值=4.32，P<0.05;q1.3=4.67，P<0.01;q2.3=4.64，P<0.01;q1.2=0.47，P>0.05

　　3 讨 论

　　3.1 新型BMP2腺病毒载体的构建

　　细菌内同源重组法是一种高效构建腺病毒载体的方法[4]，这种方法首先需要构建带有目的基因的腺病毒穿梭质粒，然后将其与腺病毒骨架质粒共转BJ5183大肠杆菌，通过细菌内同源重组机制将目的基因及其在真核细胞中表达所必需的顺势表达元件插入腺病毒基因组。pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1是美国Stratagene公司开发的一种新型腺病毒穿梭质粒，具有CMV启动子、多克隆位点和PolyA信号区等真核基因表达所必需的顺势调控元件和同源重组序列。并且在多克隆位点后依次设计安排了FLAG抗原表位(FLAG epitope, FLAG为人工合成抗原表位，其氨基酸残基序列为DYKDDDDK)基因、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site ,IRES)和GFP基因。由于IRES的存在，使插入多克隆位点的目的基因能与GFP基因以双顺反子的形式同时表达。双基因表达载体是载体构建新的发展方向，以双顺反子形式表达GFP报告基因和BMP2目的基因，同时能够对BMP2进行抗原表位标记的腺病毒表达载体可极大的方便BMP2蛋白表达检测，目前尚未见报道，是一种新的尝试。

　　实验通过PCR技术突变去除pcDNA3-BMP2所携带的BMP2基因序列中翻译终止密码子后的碱基序列，在其后添加XhoⅠ位点。添加XhoⅠ位点后使基因能够定向连接于pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1多克隆位点中的NotⅠ和XhoⅠ之间。去除翻译终止密码子之后碱基的BMP2基因序列从翻译起始密码子到FLAG抗原表位基因的碱基序列长度为1194bp，不会导致FLAG抗原表位基因的框移突变，而且由于去除了BMP2基因的终止密码子，导致两个基因的通读，使两种蛋白融合表达。重组腺病毒穿梭载体制备成功后，利用BJ5183细菌内的同源重组机制，构建了腺病毒质粒Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1和Ad CMV-BMP2。PacⅠ酶切图谱表明在不同BJ5183重组阳性克隆内，由于穿梭质粒和腺病毒质粒均存在DNA原核复制起点Ori序列，重组成功的腺病毒质粒经PacⅠ酶切后应该产生一个大于23kb的DNA 片段和约3.0kb或4.5kb的小片段两种均可以接受的情况。在已经鉴定的Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1阳性克隆中，这两种情况均已出现。而已鉴定的Ad CMV-BMP2阳性克隆， PacⅠ酶切仅产生23kb和3.0kb两种长度的DNA酶切片段(图1、图2)。

　　实验中采用了先进的细菌内同源重组法来构建腺病毒载体，从而大大节省了时间与费用。与目前普遍采用的哺乳动物细胞内同源重组法相比，这种方法具有简便、快捷、经济和高效等优势。前者在293等包装细胞内进行同源重组，细胞的状态对重组效率影响很大，通常要求传代次数不得超过45代，因此有时不得不重复引进代数较低的293细胞;另外，293细胞既是同源重组的场所，又是病毒的包装的场所，包装后的病毒需要经过反复的筛选、鉴定和纯化[5]。后者是对细菌操作，其培养、转化和重组克隆的筛选远较细胞方便、快捷和经济，技术也较成熟，从质粒转化到重组克隆的出现仅需12～20 h，加上筛选的时间也不过36 h;最重要的是，重组DNA(腺病毒质粒)经鉴定后在293细胞内包装，不需要再对病毒进行筛选和鉴定，病毒滴度和纯度都较高。

　　3.2 新型BMP2腺病毒载体的表达分析

　　为了检测所构建的新型载体表达GFP和BMP2情况，进一步将其和阳性对照载体分别转染骨髓基质细胞(MSCs)，同时用未转染载体的MSCs作阴性对照。转染3天后，首先在荧光显微镜下对活细胞进行观测，结果显示感染新型载体的细胞表达GFP(图3)。然后分别收集裂解三种细胞，提取其RNA，设计合成BMP2基因特异的正、反向引物，进行RT-PCR检测。PCR产物电泳结果显示，从转染两种重组腺病毒载体的MSCs中，均扩增出长度一致的DNA片段，这一长度符合预期设计(两引物间跨度为1190bp)，而阴性对照没有扩增出任何DNA片段，从而在mRNA水平上证实了载体表达BMP2基因的可行性(图4)。为了进一步验证载体表达产物(BMP2)的成骨诱导效应和初步了解其时间动力学规律，实验中对MSCs感染载体前后的ALP活性进行了检验，并选用感染后6、8、10、12日几个时间点对其进行了连续观测。ALP是成熟成骨细胞具有代表性的标志酶，具有水解有机磷酸物质，提高局部磷酸根浓度和水解破坏钙化抑制剂等重要功能，在体内外钙化过程中发挥关键作用，ALP升高是MSCs向成骨细胞转化的灵敏指标[6]。感染后第6日检测结果经统计学分析显示，新型载体和阳性对照载体均可以显著提高MSCs的ALP活性水平(P< 0.01)，两种载体效应差异无显著统计学意义(P>0.05)，因而在表达产物的生物学行为层次上也证明了新型载体表达BMP2基因的可行性(表1)。以连续观测结果绘制的曲线图(图5)显示，细胞感染载体后8日内ALP活性升高幅度较大，说明载体表达BMP2量或其生物活性是十分高的，短期内即可发挥明显的生物学效应;10天后上升速度明显减慢，曲线趋于平缓，ALP活性维持在一个较高水平，这可能与此时细胞生长、分化或BMP2作用已经接近饱和有关，实验中我们观察到，此时细胞生长已经铺满培养板各孔底部。从曲线图中还可以看到，MSCs本身有一定的基础表达，但水平较低，曲线基本上呈一条平滑的基线，这是因为实验所应用的MSCs是基于骨髓基质干细胞的帖壁特点获得的，并非单一的细胞类型，其中包含有少量具有分泌ALP能力的细胞类型，如成骨细胞和确定性成骨祖细胞(DOPC)等。

　　实验所构建的BMP2腺病毒表达载体与以往的BMP2腺病毒载体不同，它可以同时表达具有抗原表位标记的目的蛋白BMP2和报告分子GFP，这使新载体比原有载体具有很大的优势。首先，引入报告分子GFP使检测活细胞BMP2表达成为可能。因此，一方面可以即时监测表达情况;另一方面，细胞经检测后仍然可以用于后续实验[7]。其次，引入FLAG抗原标记增加了对目的基因的检测手段，这在缺乏目的基因特异性单克隆抗体的情况下尤为重要[8]。

　　【参考文献】

　　[1] Romano G，Michell P，Pacilio C，et al. Latest developments in gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applications[J].Stem Cells, 2000, 18(1):19-39.

　　[2] Alden TD, Varady P,et al. Bone morphogenetic protein gene therapy[J]. Spine,2002 ,27(16 Suppl 1): 87-93.

　　[3] 张正，刘丹平,等.腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2^+-IRES-hrGFP-1的构建和鉴定[J].锦州医学院学报,2005 ，26(3)：1-4.

　　[4] He TC,Zhou S,da Costa LT,et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1998 ,95(5):2009-2014.

　　[5] Mittal SK, McDermott MR, Johnson DC,et al. Monitoring foreign gene expression by a human adenovirus-based vector using the firefly luciferase gene as a reporter[J]. Virus Res,1993 ,28(1):67-90.

　　[6] Prickett KS,Amberg DC,Hopp TP. A calciumdependent antibody for identification and purification of recombinant proteins[J]. Bio Techniques, 1989,7:580-589.

　　[7] Yanne M，Michel, Andrew M, et al. Eukaryotic Initiation Factor 4G-Poly(A) Binding Protein Interaction Is Required for Poly(A) Tail-Mediated Stimulation of Picornavirus Internal Ribosome Entry Segment-Driven Translation but Not for X-Mediated Stimulation of Hepatitis C Virus Translation[J]. Mol Cell Biol, 2001,21(13): 4097–4109.

　　[8] Prickett KS,Amberg DC,Hopp TP. A calciumdependent antibody for identification and purification of recombinant proteins[J]. Bio Techniques, 1989,7:580-589.