骨切片技术在基础研究中方法的选择及应注意的问题
发表时间：2010-04-09 浏览次数：580次
作者：吕荣 作者单位：710032 陕西西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所
【摘要】 探讨骨组织的研究提供合适的固定、脱钙、切片方法的选择和在骨组织制片中应注意的问题。如什么样情况下作石蜡切片，冷冻切片，为何脱钙后再切片以及不脱钙切片，固定不好会影响切片及染色鲜艳度，甚至细胞核不着色。脱钙液的选择及脱钙彻底与否，脱钙后的冲洗都会对切片染色有着直接的关系。
【关键词】 骨研究 方法选择 骨切片
任何研究成果、学术论文，均需要有完整、鲜明、完美的组织学图像来表达，以更好地展示其真实性和科学性。观察特定的组织形态、必须选择特定的固定剂及特殊的制片方法和专门的染色方法。实验研究中要体现和谐，如观察分析骨组织内钙的成分，则不能行脱钙处理，荧光双标记的组织不能用含水量大的固定液体作为固定剂，骨组织不能脱钙原因是四环素见到水和酸性物质荧光会减弱或消失。组织学技术是一套完整而工序繁多的技术，在制作过程中要科学、认真、耐心细致地做好每一步程序，只要有一步出错，肯定会给切片或染色造成不良的影响。笔者根据多年的体会，总结分析如下。
1 固定剂的选择
在制片过程中组织固定非常重要，固定是否彻底，直接影响切片的完整性和染色的鲜明度。固定的意义是防止组织结构形态的改变和组织内的物质产生自溶。最大限度地保持组织内成分与活时的形态相仿。同时固定液对组织有媒染作用，使之组织成分对染料有不同的亲和力，更好地让组织各部易于着色。观察不同的组织细胞和不同的组织形态，固定剂的选择更为重要。在选择固定剂之前要了解固定剂的作用和机制，搞清切片的目的和要求。常规的骨组织固定剂10%～50%中性甲醛。因为甲醛对组织有极强的穿透作用。中性甲醛对神经组织、运动终板、感觉小体、脂肪组织都有很好的固定作用。而观察四环素荧光则不能用甲醛固定，因为甲醛含水多，四环素见水后易被溶解，荧光会减弱甚至消失。四环素荧光最好的固定剂是丙酮或乙醇。丙酮对酶类有极好的固定作用。染脂肪组织不能用乙醇作固定剂。乙醇对糖类物质有很好的固定作用，如中性多糖、酸性多糖、肝糖等[1～3]。
固定液的量应是组织块大小的20～30倍，最好在固定组织的容器的底部和四周垫几层纱布，这样有利于固定液从组织的周围渗入组织的内部，使组织得到充分的固定。在入固定液前把组织上的血及污物冲洗干净。要想得到良好的染色效果，组织必须在离体后10～15 min内投入固定液内。
2 脱钙液的选择
骨组织内含有大量的钙盐，要制出切片完整染色优良的骨切片，选择合适的脱钙液和脱钙彻底与否非常关键，脱钙合适切片成功达80%[4～5]。笔者认为，混合脱钙液比单一脱钙液好，脱钙液内加一点甲醛，至少有边固定边脱钙的作用，Cook和Eira(1962)证明，未固定的组织在酸性脱钙液中受到的损害比已固定组织大3倍，充分说明在固定液内加一定量的固定液是必要的。
骨组织脱钙前后处理也特别重要，为了确保骨组织充分固定和完全脱钙，骨块的厚度不应超过5 mm。经脱钙和水洗后，切面需要修整，切除被锯齿损伤的部分。脱钙的时间应根据组织块的大小，厚度温度而定。加温可使脱钙速度加快。加温在37 ℃以上脱钙速度加快，但会引起组织过度膨胀，甚至会影响组织着色。特别对做组化染色的组织，一般无特殊急用，不提倡用加温的方法增加脱钙速度[6，7]。
选用脱钙剂的标准：(1)脱钙均匀。(2)适当的脱钙速度。(3)尽量选择对组织细胞和纤维损伤小的脱钙液。
确定脱钙终点的标准：Χ线照相，如显相，钙未脱干净。钙质化学试验法。一般常用针刺法，这种方法简单实用，针轻轻刺入骨组织，则说明脱钙已彻底，反则继续脱钙。
脱钙后的冲洗：脱钙后骨组织内含有大量的酸性物质，因此脱钙完成后则需要彻底洗除骨组织内的酸。先用专门的冲洗器冲洗3～4 h，在用5%硫酸钠中和2～3 h，流水继续冲洗1～2 h，只要冲洗干净，会制出优良的骨切片和染色。
切片时易出现的困难:(1)脱钙不彻底。(2)脱水透明时间过长或过短。(3)切片刀不够锋利。(4)刀刃与组织的角度过大或过小。(5)对症处理。
3 小结
骨组织是制片中最难切的一种组织，因为骨组织坚硬。如脱钙，脱水，透明的时间掌握不好组织易变脆。根据笔者的经验，只要把握好制作中的每一个步骤，获得优质切片并不困难。
【参考文献】
1 Qin L, Yang L, Katz JL. Overview of contact Microradiography, Back-scattered scanning electron microscopy, and Nane-indentation.Compendium of 2002 international Bone Research Instructional Course and Hands-on Workshop. Hong Kong SAR, PR China，2002，288-294.
2 龚志锦，詹熔洲.病理组织制片和染色技术.上海：上海科学技术出版社，1994，110.
3 吕荣，杨光.塑料不脱钙、石蜡包埋 、明胶浸泡法对骨组织切片的比较.临床与实验病理学杂志，1999，15(5)：464.
4 吕荣，徐新智，王军.塑料包埋不脱钙大块骨组织切片及染色.临床与实验病理杂志，2002，18(3)：342.
5 吕荣，徐新智，王军，等.塑料包埋切血管内带金属支架及改进的弹力染色法.临床新进展，2003，1(5)：294.
6 吕荣，徐新智，张韬，等.不脱钙大块骨切片及染色的改进.中华临床医学杂志，2004，5(4)：85.
7 吕荣，王军，徐新智，等.塑料包埋非脱钙技术在骨组织学与图像分析中的应用.临床与病理学杂志，2006，3：369-370.
