狼疮性肾炎患者淋巴毒素β表达及相关性研究

　　作者：孙敏,李咏梅,张亚丽　　作者单位：北华大学检验学院，吉林 吉林 132013

　　【摘要】目的探讨淋巴毒素β(LTβ)在狼疮性肾炎发病及免疫调节紊乱中的作用。方法 用ELISA检测血清LTβ水平，PBL RNA斑点杂交测定LTβ基因转录水平;PCRRLFP法分析LTβ基因多态性。结果 狼疮性肾炎患者血清LTβ水平比正常显著增高(P<0.01)，与未合并狼疮性肾炎组比亦显著增高(P<0.01);基因转录水平比正常对照组显著增高(P<0.05)，与未合并狼疮性肾炎组比亦显著增高(P<0.05)。未发现LTβ基因的XhoⅠ酶切位点具有多态性。结论 提示LTβ是导致狼疮性肾炎发生的主要因子，LTβ参与SLE的免疫调节紊乱。

　　【关键词】 狼疮肾炎;淋巴毒素β;基因;系统性红斑狼疮

　　Study on the expressions of lymphotoxinβ in lupus nephritis patients and correlational

　　SUN Min,LI Yongmei，ZHANG Yali (Medical College of BeiHua University，Jilin City,Jilin Province,132013,China)

　　Abstract:Objective To study the effect of LTβon inordinate immunoregulation in lupus nephritis patients. Methods The level of LTβprotein in patients seurm were detected with ELISA.The level of LTβgene transcription were detected with hybridiztion.The polymorphism of LTβgene were investigated by PCRRFLP analysis. Results The level of LTβprotein showed significant difference between lupus nephritis patients and control groups(P<0.01);The level of LTβprotein showed significant difference between lupus nephritis patients and non lupus nephritis patients groups(P<0.01).Hybridization by using LTβ DNA probe showed significant difference between lupus nephritis patients and control groups(P<0.05);Significant difference between lupus nephritis patients and non lupus nephritis groups was also showed(P<0.05).In both groups,the PCR products of LTβgene 240 bp fragment were digested with XhoⅠ. Conclusion The results suggested the LT-βwas the important cytokine to conduct lupus nephritis and involve in the inordinate immunoreglution in SLE.

　　Key words:lupus nephritis;lymphotoxinβ;gene;systemic lupus erythematosus

　　作者简介：孙 敏(1964-)，女(汉族)，副教授，硕士.

　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多器官多系统的自身免疫性疾病，虽然病因及发病机制尚不清楚，但较一致的观点是：SLE是由多种遗传或环境因素综合作用的结果，免疫系统异常是其突出表现。SLE的严重程度和病变范围是由致炎和抗炎的细胞因子之间的平衡来决定的，SLE的不同表现型其细胞因子的产生也有差异[1]。通过不同种族人群调查、家系调查、双生子研究等发现：SLE的发病存在显著的遗传易感性[2]。淋巴毒素β(lymphotoxinβ，LTβ)是TNF家族的新成员，其基因位于MHCⅢ类区与TNFα、TNFβ基因紧密相连，自它被发现起即被认为与免疫调节密切相关[3]，但其在SLE中的作用还是未知。本研究检测了狼疮性肾炎患者LTβ蛋白及基因转录水平，并对LTβ基因XhoⅠ酶切位点进行了多态性分析，旨在探讨LTβ在狼疮性肾炎的发生及免疫调节紊乱中的作用，寻找SLE的易感基因。

　　1 材料和方法

　　1.1 SLE患者及健康对照血样

　　SLE患者血样取自北京协和医院内科门诊及住院患者，诊断均符合美国风湿病协会1982年修订的SLE分类标准11条中的至少4条，患者平均年龄34.7岁。根据全身症状及有关实验室检查而分为LN组(82例)和非LN组(73例)。健康对照血样取自健康自愿者，共90例，平均年龄为36.8岁。

　　1.2 试 剂

　　Taq DNA聚合酶、RTPCR试剂盒均购自Perkin Elmer公司;限制性内切酶Xho 购自New England Biolabs;LTβ试剂盒购自Bothringer mannhein公司;LTβPCR引物由美国Bioserve Biotechnologies，Ltd合成。

　　actin PCR引物序列：

　　L(sense)：5′ATCATGTTTGAGACCTTC3′

　　R(antisense)：5′CATCTCTTGCTCGAAGTC3′

　　LTβPCR引物序列：

　　L(sense)：5′GCTGCGCAGCTCTCTGTAC3′

　　R(antisense)：5′AAGAAGGTCTTCCCTCTCGC3′

　　1.3 探针制备

　　LTDNA探针由M31A克隆经BamHI/KpnI酶切获得。Actin cDNA探针以Control RNA为模板，经RTPCR扩增得Actin cDNA片段，琼脂糖凝胶电泳检出317 bp片段。以control RNA(1 μg/μl)为模板做反转录，反应体系为20 μl。取5×缓冲液4 μl，Random primers 1 μl，DTT(0.1 mol/L)2 μl， NTP(10 mmol/L)4 μl。RTanzyme(200 U/μl)1 μl，DEPC处理水8 μl，模板1 μl，混匀37℃保温1 h。PCR扩增actin cDNA。

　　1.4 方 法

　　ELISA法检测血清LTβ，外周血淋巴细胞(PBL)总RNA提取，盐析法提取人基因组DNA;随机引物标记法标记DNA探针，PBL RNA斑点杂交，PCRRFLP法分析LTβ基因多态性。

　　以25 μl PCR反应体系进行反应。取4dNTP 1 μl，MgCl2(25 mmol/L)1 μl，10×缓冲液2.5 μl，清毒去离子水16.5 μl，LTβL、R引物(50 ng/μl)各1 μl及待检DNA 1 μl，混匀，2 000 rpm离心30秒，96℃预变性6 min后，加入Taq酶1 μl(5 U/μl原液用去离子水1∶2稀释)，混匀，2 000 rpm离心30秒， 96 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min的程序循环30次后于72℃再延伸5 min。

　　取PCR反应产物7 μl，加入10×Universal Buffler 2 μl，XhoⅠ(10 U/μl)2 μl，去离子水9 μl，置37℃水浴消化4 h。取消化产物5～10 μl，按6∶1(V/V)与上样缓冲液混合，加于1%琼脂糖凝胶中，1×TAE缓冲液中50 V电压电泳1 h，于紫外灯下参照DNA Marker观察结果。

　　2 结 果

　　2.1 血清LTβ蛋白水平检测结果

　　各组血清LTβ蛋白水平检测结果见表1。血清LTβ蛋白水平检验结果显示LN组血清LTβ蛋白水平比正常和非LN组均显著增高(P<0.01);而非LN组与正常对照比较虽然均增高，但在统计学上无显著差异(P>0.01)。

　　2.2 PBL RNA斑点杂交结果

　　LTβ杂交后将显影X片经激光密度扫描后，LTβ扫描值与actin扫描值相比结果见表1(为了便于统计，各扫描值×10 000)。经统计检验可得LN组比正常对照组增高显著(P<0.05);LN组与非LN组显著增高(P<0.05);非LN组与对照组比虽然均值增高，但由于SD大，两者在统计学上无显著性差异(P>0.05)。

　　2.3 LTβ基因的PCRRFLP分析

　　M31A克隆经BamHI/KpnI酶切得约9 kb片段，以该片段为模板用两对引物行PCR扩增，分别得到240 bp和131 bp期片段;LTβ基因第4外显子中存在XhoⅠ酶切位点[2]，用XhoⅠ酶切240 bp基因片段，本实验共分析SLE患者82例，正常对照90例，结果两组的240 bp片段均被XhoⅠ酶切为178 bp和62 bp两个片段。酶切后电泳结果见图1。实验结果未发现LTβ基因具有多态性。表1 各组血清LTβ值及PBL RNA斑点杂交扫描值

　　3 讨 论

　　SLE是一种原因不明的自身免疫疾病，其突出特点是广泛的免疫系统异常。SLE的免疫异常涉及多种免疫调节因子水平的改变，其改变导致许多合并症的发生，其中狼疮性肾炎就是SLE严重的合并症之一。有报道患者体内低水平TNFβ是狼疮性肾炎的发病因素之一[4];LTβ是TNF家族的新成员，早在1977年Heiserodt等人报道了用Lectin刺激的人外周血淋巴细胞(PBL)，在细胞膜上发现了膜联淋巴毒素(mLT)，其后相继报道在不同细胞膜上发现mLT。Androlewizc等人证实它是由LT与一种33KD糖蛋白(P33)而成的非同质三聚体[3]。1993年，Browning等人克隆了编码该蛋白的cDNA，并找出其基因组位点，令人惊奇发现它与TNFα、TNFβ基因紧密连锁，具有同源性，于是命名P33蛋白为淋巴毒素β(LTβ)，而将LT(TNFβ)命名为淋巴毒素α。

　　由于LTβ基因所处位置的重要性，及其存在于激活的淋巴细胞上，推测它在免疫调节中起重要的作用。本实验的研究结果显示狼疮性肾炎患者血清LTβ蛋白水平明显高于正常人及非狼疮组(P<0.01);斑点杂交，我们发现在狼疮性肾炎中LTβ转录比正常对照及非狼疮组显著增高(P<0.05)。提示LTβ可能参与SLE的广泛免疫调节紊乱，是狼疮性肾炎的发病因素之一。另有报道，狼疮性肾炎患者体内IL10、IL2显著增高，IL2能刺激LTβ大量表达[56]。因此SLE的发病是由于遗传和/或环境因素引起的一种或几种细胞因子的异常表达，导致细胞因子网络的失衡而最终导致SLE的发病。对细胞因子的异常表达的进一步研究有助于进一步阐明SLE的发病机制。

　　许多研究发现，SLE的发病存在显著的遗传易感性[2]，并且90年代初发现了处于HLAⅢ类区域中的TNFβ基因NcoⅠ多态性位点，观察到德国人TNF*1等位基因频率在SLE患者中比对照组显著增高[7]。我们对LTβ基因的XhoⅠ酶切位点进行了多态性分析，就本实验结果未发现此酶切位点具有多态性。关于LTβ参与SLE免疫调节紊乱的具体机制还需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Oates J C,Gilkeson G S.Mediators of injury in lupus nephritis[J].Curr Opin Rheumatol,2002,14(5):498503.

　　[2] Sullivan K E.Genetics of systemic lupus erythematosus:clinical implications[J].Rheum Dis Clin North Am,2000,26(2):229256.

　　[3] Browning J L,Ngamek A,Lawton P,et al.Lymphotoxin beta,a novel member of the TNF family that forms a heteromeric complex with lymphotoxin on the cell surface[J].Cell，1993，72(6)：847849.

　　[4] 江 林，刘雅然，谢红付，等.肿瘤坏死因子β*2等位基因与狼疮性肾炎的相关性分析[J].临床皮肤科杂志，2003，32(2)：6566.

　　[5] Chang D M,Su W L,Chu S J.The expression and significance of intracellular T helper cytokines in systemic lupus erythematosus[J].Immunol Invest,2002,31(1):112.

　　[6] Horwitz D A,Wang H,Gray J D.Cytokine gene profile in circulating blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus:increased interleukin2 but not interleukin4 mRNA[J].Lupus,1994,3(5):423428.

　　[7] Bettinotti M P,Hartung K,Deicher H,et al.Polymorphism of the tumor necrosis factor beta gene in systemic lupus erythematosus:TNFBMHC haplotypes[J].Immunogenetics,1993，37(6):449454.