高糖诱导人肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

　　作者：马玉香1,白光辉1,白雪源2,李作祥2　　作者单位：1.青海大学医学院;2.解放军总医院肾病科暨全军肾病研究所

　　【摘要】目的 探讨高血糖对人肾小管上皮细胞活性氧(ROS)产生及凋亡的影响。方法 将人近端肾小管上皮细胞(HKC)分别以不同时间在含有5.5 mM D(右旋)-葡萄糖(正常糖对照组)、25 mM D-葡萄糖(高糖组)和20 mM L(左旋)-葡萄糖+5.5 mM D-葡萄糖(渗透压对照组)的DMEM培养基中培养。用化学发光法特异性检测细胞内H2O2水平。将细胞用荧光染料CM-H2DCFDA标记后用激光共聚焦显微镜检测活细胞中总ROS水平。用荧光染料Hoechst 33258 对细胞染色后在荧光显微镜下计数细胞凋亡率。用AnnexinV-FITC/碘化丙锭双染后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。在高糖组中同时加入30 mM的抗氧化剂牛磺酸，观察其对细胞凋亡的影响。结果 化学发光法检测和共聚焦显微镜检测显示高糖可明显促进肾小管上皮细胞内活性氧的产生，与其他两对照组比较有显著差异(P<0.01);Hoechst 33258 染色法检测和流式细胞仪检测分析显示高糖可明显诱导肾小管上皮细胞的凋亡发生，与其他两对照组比较有显著差异(P <0.01);流式细胞仪检测分析显示抗氧化剂牛磺酸可明显抑制高糖诱导的肾小管细胞凋亡，与高糖组比较有显著差异(P<0.01)。结论 高糖可通过促进细胞内生成过量ROS而诱导肾小管细胞凋亡发生，抗氧化剂可阻断高糖诱导的肾小管细胞凋亡。

　　【关键词】 高糖 肾小管 活性氧 凋亡 牛磺酸

　　THE MECHANISM OF APOPTOSIS INDUCED BYHIGH GLUCOSE IN HUMAN RENAL TUBULAR EPITHELIAL CELLSMa Yuxiang1 ， Bai Guanghui1， Bai Xueyuan2， Li Zuoxiang2， Feng Zhe2， Fu Bo2(1. Qinghai University Medical College;2. Chinese PLA Institute of Nephrology, Chinese PLA General Hospital)Abstract Objective To investigate the effect of high glucose on ROS production and apoptosis in the renal tubular epithelial cells and to elucidate the molecular mechanism of renal tubule apoptosis induced by high glucose. Methods Human proximal renal tubular cell line HKC was cultured in DMEM medium containing 5.5 mM D(Dextrorotation)-glucose (normal glucose control), 25 mM D-glucose (high glucose) and 5.5 mM D-glucose + 20 mM L(Laevorotation)-glucose (osmotic pressure control) for different time. Chemoluminescence assay was used to detect H2O2 level intracellularly. ROS (reactive oxygen species) content in HKC was determined with laser confocal microscope after the cells being labeled with fluorescent dye CM-H2DCFDA. After Hoechst 33258 staining, apoptosis rate of the HKC cells was counted under fluorescent microscope. Flow cytometry was used to determine apoptosis rate of HKC cells after dual staining with AnnexinV-FITC/propidium iodide. Meanwhile, 30 mM antioxidant taurine was added into medium containing 25 mM D-glucose and its effect on apoptosis of renal tubular cells was observed. Results Chemoluminescence and confocal microscope analyses indicated that high glucose in the medium can promote generation of an excess of ROS in the renal tubular epithelial cells，compared with two other control groups(P<0.01). Hoechst 33258 staining revealed that high glucose can obviously increase apoptosis rate in renal tubular cells, compared with two other control groups (P<0.01). Flow cytometry analysis showed that taurine can markedly inhibit apoptosis of renal tubular cells induced by high glucose. Conclusion High glucose can induce apoptosis of renal tubular cells by promoting generation of an excess of ROS in human renal tubular cells and taurine can block apoptosis of renal tubular cells induced by high glucose.

　　Key words High Glucose Renal tubule Reactive oxygen species (ROS) Apoptosis Taurine

　　目前对高糖诱导肾小管细胞氧化损伤及凋亡的机制还未阐明。本研究拟通过观察高糖对肾小管细胞活性氧产生以及凋亡的影响，明确高糖导致肾小管上皮细胞凋亡的分子机制，从而为糖尿病肾病的防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　D(右旋)-葡萄糖和L(左旋)-葡萄糖、凋亡检测荧光染料Hoechst 33258及流式细胞分析试剂碘化丙锭(PI)购自 Sigma公司。活性氧检测荧光探针CM-H2DCFDA购自Molecular Probes 公司。

　　1.2 细胞培养及实验分组

　　人近端肾小管上皮细胞系HKC来自解放军总医院肾病研究所，液氮中冻存，复苏后置于DMEM完全培养基中，放在37℃、 5% CO2饱和湿度的温箱中培养，每2～4天传代一次。待细胞同步化后，分别各加入5.5 mM D-葡萄糖(正常血糖组)、25 mM D-葡萄糖(高血糖组)、5.5 mM D-葡萄糖+20 mM L-葡萄糖组(渗透压对照组)分别作用 0.5 、2、18、24、48 h。

　　1.3 肾小管上皮细胞内H2O2水平的检测方法

　　在发光剂Luminol(3-aminophthalhydrazide，3-氨基苯二甲酰肼)中加入辣根过氧化物酶诱导定向化学发光，然后用BPCL-超微弱发光分析仪进行相关测量。细胞分3组，同步培养后吸弃陈旧培养液，预温的PBS洗2次。反应混和总体积为1 ml，含PBS 800 μl、Luminol 120μl、辣根过氧化物酶10IU，分别加入5.5 mM D-葡萄糖、25 mM D-葡萄糖、5.5 mM D-葡萄糖+20 mM L-葡萄糖到不同细胞组时启动反应。完整的信号峰反映H2O2的生成量。

　　1.4 细胞内ROS含量的检测方法

　　将3组不同糖处理HKC细胞接种于平底的激光共聚焦专用玻璃平皿中，待细胞长满后用37 ℃预温的PBS洗1次，然后与10μM的荧光染料探针CM-H2DCFDA共孵育30 min，最后用激光共聚焦显微镜分析细胞内各种ROS水平(激发波长480 nm，发射波长505～530 nm)。

　　1.5 高糖诱导细胞凋亡的观察方法

　　将3组不同糖处理HKC细胞涂片用甲醇：冰醋酸(3：1)固定液4℃固定5 min，蒸馏水稍洗后，加Hoechst 33258荧光染料(1μg/ml)作用10 min，蒸馏水洗片后，用滤纸吸去多余液体。封片液(20 mM柠檬酸，50 mM磷酸二钠，50%甘油调制，pH5.5)封片后在荧光显微镜下观察并照相，计算凋亡细胞百分率。

　　1.6 抗氧化剂对高糖诱导肾小管细胞凋亡影响的观察方法

　　实验分3组：正常糖组、高糖组、高糖+牛磺酸组(在高糖培养的细胞中加入30 mM的牛磺酸)。细胞培养48h后将上述3组细胞分别用0.25%胰酶消化后离心，加入Annexin V-FITC和碘化丙锭(PI)双染，于室温下避光孵育5分钟，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

　　1.7 统计学处理方法

　　用图像分析处理系统Image Master VDS扫描。图像输入计算机用Image Master TotalLab分析软件进行灰度分析，每组实验至少进行3次，结果中所示图显示的为代表性的结果。使用SPSS12.0软件对数据进行统计分析，所有正态分布计量资料使用均数±标准差 (x±S)表示，各组间比较采取单因素方差分析和Dunnnett-t检验，率采用两样本率的u检验，取检验标准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 高糖对肾小管细胞内H2O2生成的影响

　　在培养的细胞中分别加入上述不同浓度的葡萄糖进行处理，然后用化学发光法检测细胞内H2O2的产生水平。结果显示，右旋高糖刺激时，H2O2含量呈现脉冲式增加，很快达到高峰，随后下降到正常糖培养组的水平。Dunnett- t 检验显示120 s时高糖组与正常糖组和渗透压组比较均有明显差异(P<0.01)。750 s时高糖组与正常糖组比较有明显差异(P<0.05)，高糖组与渗透压组比较有明显差异(P<0.01)，高糖组较其他两组H2O2生成明显增加。图1是一次代表性检测结果，该图显示的是H2O2生成量随时间的曲线趋势。表1显示的是检测结果。表1不同糖浓度刺激HKC时H2O2的生成量(注：*高糖组与正常糖组和渗透压组比较均P<0.01;**高糖组与正常糖组比较P<0.05,高糖组与渗透压组比较P<0.01.

　　2.2 高糖对细胞内ROS产生水平的影响

　　我们将培养的3组细胞用ROS荧光染料CM-H2DCFDA对活细胞进行染色，然后用激光共聚焦显微镜进行检测。结果显示与正常浓度葡萄糖培养的细胞相比，高糖培养可使肾小管细胞内ROS 的产生量明显增加(图2B)，在高糖作用2 h时，在显微镜下呈明显的绿色，而正常糖组和渗透压组的荧光很弱(图2A和2C)。后高糖组的荧光也逐渐减弱，到24 h时与两对照组一样。

　　2.3 高糖对肾小管细胞凋亡的影响

　　Hoechst 33258是一种蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，当被活细胞摄取后可与细胞核DNA结合，在紫外灯下细胞核被染成蓝色荧光。细胞分别用正常生理浓度(5.5 mM)和高浓度(25 mM)的D-葡萄糖处理48 h后进行染色。结果显示，高糖处理组细胞核呈浓染致密的固缩状或呈颗粒状(图3B)，凋亡率为24.21%;正常对照组(图3A)细胞核呈弥散均匀的低密度，凋亡率为6.74%;渗透压组凋亡率为7.72%(图3C)，经两样本率的u检验，高糖组凋亡率与正常糖组和透压组比较均有显著差别(P<0.01)，表明高糖明显诱导了细胞的凋亡。渗透压组与正常糖组比较，凋亡率无明显差异(P>0.05)。

　　2.4 抗氧化剂对高糖诱导肾小管细胞凋亡的影响

　　我们用AnnexinV-FITC/碘化丙锭对正常糖、高糖及加入牛磺酸的高糖处理的细胞进行双染，然后用流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡率。结果显示，细胞作用48 h后，高糖处理组肾小管细胞(图4B)的早期凋亡率(10.0%)明显高于正常葡萄糖组(图4A)的凋亡率(3.6%)(P<0.01)。高糖中同时加入30 mM的抗氧化剂牛磺酸作用48 h后，结果发现其可明显抑制高糖诱导的肾小管细胞凋亡(图4C)，其凋亡率为3.2%。高糖组凋亡率与加入牛磺酸高糖组比较，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。结果显示抗氧化剂牛磺酸可明显抑制高糖诱导的细胞凋亡。

　　3 讨论

　　人近端肾小管高度依赖有氧代谢合成ATP，在线粒体内通过三羧酸循环和氧化磷酸化过程可产生ATP，但线粒体同时也是ROS产生的主要部位 [4]。

　　ROS是生物体在有氧代谢过程中产生的一类性质十分活泼的含氧化合物，主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(-OH)和过氧化氢(H2O2)及一氧化氮 (NO) 等。ROS具有重要的生理学作用，参与机体的杀菌防御机制。近年发现ROS作为一种重要的细胞内信号分子参与了细胞增殖、分化和凋亡等许多重要的细胞行为 [4,5]。在生理条件下，细胞内产生的ROS量较少，而且机体内存在着抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽等可以清除ROS，使ROS的产生和清除保持动态平衡。但在某些病理情况下，体内ROS产量大大增高，超过了细胞内的抗氧化能力时便发生氧化应激(oxidative stress)，从而引起组织细胞的氧化性损伤，可导致细胞死亡或凋亡。研究表明ROS可直接造成蛋白、脂质及线粒体DNA等生物大分子的氧化性损伤 [6]。ROS可能在糖尿病肾病的发生发病中起着关键性作用。ROS被考虑在肾固有细胞凋亡中起介导作用 [7]。

　　本研究中，我们观察了高糖对肾小管上皮细胞活性氧产生及凋亡的影响。结果与国外在神经细胞中的研究结果相似 [7]。我们推测高糖在短时间内可诱导ROS水平升高。但如果细胞长期处于高糖环境中，则会损伤线粒体中的呼吸链，进而使ROS的产生下降。

　　我们进一步研究发现高糖可促进肾小管细胞的凋亡，还发现加入抗氧化剂牛磺酸后可明显抑制高糖诱导的肾小管细胞凋亡，表明高糖是通过促进ROS的过量产生而诱导了肾小管上皮细胞的凋亡。总之，本研究初步明确了高糖可通过促进肾小管细胞产生过量活性氧而导致肾小管细胞凋亡的事实，此为糖尿病肾病的防治提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　1] Radbill B, Murphy B, LeRoith D. Rationale and strategies for early detection and management of diabetic kidney disease[J]. Mayo Clin Proc, 2008, 83(12):1373-81

　　[2] Chang SS. Albuminuria and diabetic nephropathy[J]. Pediatr Endocrinol Rev, 2008, 5:974-979

　　[3] Ishibashi Y, Sugimoto T, Ichikawa Y, et al. Glucose dialysate induces mitochondrial DNA damage in peritoneal mesothelial cells[J]. Perit Dial Int ,2002, 22(1): 11-21

　　[4] Lee HB, Yu MR, Song JS, et al. Reactive oxygen species amplify protein kinase C signaling in high glucose-induced fibronectin expression by human peritoneal mesothelial cells[J]. Kidney Int, 2004, 65(4): 1170-1179

　　[5] Ha H, Yu MR, Choi YJ, et al. Role of high glucose-induced nuclear factor-kappaB activation in monocyte chemoattractant protein-1 expression by mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol ,2002, 13(4): 894-902

　　[6] Wei YH, Lee HC. Oxidative stress, mitochondrial DNA mutation, and impairment of antioxidant enzymes in aging[J]. Exp Biol Med, 2002, 227(9): 671-682

　　[7] Russell JW, Golovoy D, Vincent AM, et al. High glucose-induceded oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurons[J]. FASEB J, 2002, 16(13): 1738-1748