富血小板血浆促进骨缺损修复的进展

作者：浦津，何耀华，刘卫华    作者单位：1.上海市闸北区市北医院，上海 200443；2.上海市第六人民医院，上海 200233 　　【关键词】  富血小板血浆 骨缺损修复

　　富血小板血浆(plateletrich plasma，PRP)是通过离心自体全血而得到的含高浓度血小板的血浆。PRP中含有高浓度生长因子，如：血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、类胰岛素生长因子(insulinlike growth factor，IGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等［1～3］。经酶联免疫吸附试验证实，PRP中除IGF以外，其余四种生长因子的浓度约为体内正常浓度的3～8倍［4］。PRP在各种动物以及临床试验中显示了良好的促进骨缺损修复的特性［5～8］。自1998年Marx等［9］首次用PRP复合移植骨修复下颌骨缺损以来，国外近期已逐渐应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等多种学科。

　　1  生长因子与富血小板血浆(PRP)的制作  

　　生长因子是一类天然生物介质，对细胞的增殖、分化、趋化、胞外基质合成及血管再生有着重要的作用［10～11］，PDGF具有较强的促有丝分裂和细胞趋化作用，可促进骨髓基质干细胞增殖，也可促进周围组织或血液中的间充质细胞向局部聚集［12］。TGFβ对成骨前体细胞有促进增殖和趋化的作用，可加速胶原形成，对组织愈合和新骨形成均有促进作用，同时能抑制破骨细胞形成，故能抑制骨吸收［13］。VEGF在伤口愈合和新生血管生成上有着重要作用［14］。IGF由于能促进Ⅰ型胶原和骨基质形成，从而能促进新骨形成［13，15］。1984年Assoian等［12］发现PRP与CaCl2及凝血酶混合后，生长因子即从血小板的α颗粒中释放出来。Assoian的这一发现，为骨缺损修复提供了一个崭新的思路，使PRP成为众多学者们研究的热点。    　　目前获得生长因子的途径是基因重组或从动物身上提取，但都费用多、时间较长且制作复杂。纯化的生长因子价格昂贵，生长因子的适用剂量及各生长因子之间的最佳比例还未阐明。外源性的生长因子常由于一定的免疫排斥反应而使修复达不到满意的效果。

　　目前制备PRP的方法主要有血浆分离置换法和离心分离法。血浆分离置换法是利用多功能医用血成分自动分离设备单采PRP，制备得到浓缩PRP成分。该方法自动化程度高，制备的PRP纯度和浓度均高，但是该设备价格昂贵，限制了其在临床上的广泛应用。目前主要采用手工离心分离法采集PRP，该方法对设备要求低，价格低廉，步骤简单。但以下缺点限制了其在临床上的推广应用［16］：a)在开放的系统内制备容易受外界污染；b)多个容器中转移，增加了PRP激活和被污染的机会；c)PRP回收率相对较低；d)易受操作因素的影响，制备的PRP相关指标变异系数较大。

　　不论是机器制作还是手工制作，其原理均相似。即利用血液中各组分的沉降系数不同，使得血液一次离心后分为三层，最底层是沉降系数最大的红细胞，最上层是上清液，交界处有一薄层(肉眼不易看出)，即富血小板层；一次离心后弃去上清液或者红细胞层，然后改变离心力再次离心，可使更多的血小板分离出来。目前对PRP制作方法还存在颇多争议。Landesberg等［17］以不同离心力和离心时间二次离心制作PRP，发现离心力大于250 g会导致血小板破坏过多。如一次离心时间少于5 min，得到的PRP中血小板浓度与全血无显著性差异。建议一次离心后弃去红细胞，二次离心时均采取200 g离心力离心10 min较好。而Marx［18］认为，制作PRP时首先需要高速离心，弃去上清液后再低速离心，可更好地提取血小板。两次离心法在离心力(g)与离心时间(min)的选择上，其最佳值约为离心力乘以时间的两次总和不大于11 000 g·min。当超过11 000 g·min并随着该值的进一步增大，血小板将被大量破坏，造成生长因子流失［7］。多数学者认为，首次低速离心后吸取全部上清液和交界面下的红细胞层，于另一支离心管再次以高速离心，得到的PRP中血小板回收率较高。PRP中各有效成分的含量及其比例因制作方法的不同而不同，其机制尚需进一步研究。    　　血小板与生长因子浓度的关系也较复杂，有学者认为［19］可能受制作过程中多种因素的影响所致。在体外时血小板容易受外源性刺激而遭破坏，例如抽血时间过长、针头过细、应用止血带、不适当的抗凝剂和贮血容器、摇匀程度、放置时间等都会造成人为的血小板活化。另外，血小板激活方式(冷冻激活、凝血酶激活)、激活的完全程度、生长因子检测试剂盒的灵敏度，也会影响生长因子浓度值的变化。

　　关于PRP中血小板浓度问题，现在普遍认为只要能达到全血血小板浓度的3.8倍以上或更高，就可发挥相应的生物学效应。但Weibrich等［20］通过应用不同浓度的富血小板血浆修复骨缺损，发现血小板浓度与其相应的生物学效应并不成比例，最佳的浓度在4～7倍之间。

　　2  富血小板血浆(PRP)促进骨修复机制

　　目前研究表明，生长因子有明确的骨诱导能力，但单纯应用生长因子于局部，因其半衰期短、易降解或随血循环稀释，不能在局部保持长期的有效浓度［21］。所以必须与载体复合构成一缓释系统，以保证局部形成长期有效的治疗浓度。目前常用的PRP载体有自体骨、异种骨或异体骨以及人工骨。用自体骨作PRP载体修复骨缺损，其疗效报道不一。有学者认为PRP中的生长因子与来自自体骨中的EMP相互作用，抑制效应占主导地位，降低成骨能力［22］，所以能否用自体骨作为载体，还有待于进一步研究。目前的人工骨还达不到作为一种良好载体的要求［23］。有学者认为异种蛋白骨具有与人体松质骨相似的形态和组织结构，其多孔结构能够有效增加表面积，为更多的血管生成和新骨形成提供场所，另外，其多孔结构能提高异种骨与宿主骨的连接。脱蛋白异种骨具备了作为PRP良好载体的基本条件，是一种良好的载体。因此，临床上利用复合外源性生长因子的人工骨材料修复骨缺损还难以普遍展开。    　　PRP促进骨修复是由于其分泌的多种高浓度生长因子的联合作用，其中又以PDGF和TGFβ最为重要。PDGF可增加局部成骨细胞的数量和毛细血管的生长；TGFβ可使骨细胞增多，并促进成纤维细胞基质的形成和成骨细胞基质的沉积，也有利于移植区毛细血管的生成。

　　Fennis等［5］推测，PRP促进骨缺损的修复机制可能是应用早期大量促进细胞的增殖，以后随着PRP直接作用的减退，增殖的细胞分化活性提高，在一个较高的水平上进一步增殖与分化而促进骨缺损修复。Marx等［9］推测，除了早期PRP中生长因子直接促进局部细胞的增殖与分化外，随着时间的推移，巨噬细胞将被趋化到骨缺损部位，代替血小板，分泌多种生长因子，如巨噬细胞源性生长因子、TGFβ等，成为生长因子的主要来源，从而长期促进骨缺损的修复。    　　PRP在凝血酶或钙离子的作用下可形成自体纤维蛋白凝胶，使复合的移植骨颗粒黏附在一起，减少颗粒骨的分散与移位，减少异位骨化，增强移植骨的骨传导作用。同时，自体纤维蛋白凝胶提供了一个有利于成骨细胞增殖与分化的微环境，从而促进骨缺损的修复［24，25］。

　　有实验［11］证实，多种生长因子联合应用在骨修复过程中往往产生较好的协同作用。PRP是由自体全血浓缩而成，其中各生长因子间具有最佳的浓度配比，在骨修复过程中可能发挥较好的协同作用，促进骨缺损的修复。

　　3  展望及当前存在问题

　　目前，将PRP按一定比例与凝血酶钙剂(10∶1)混合凝固形成的胶状物质，不仅具有加速止血、封闭创面的特点，还能加速创面愈合，已在创伤修复领域得到广泛应用［26，27］，广泛应用于口腔颌面外科、骨科、烧伤整形科和慢性溃疡等的治疗［28，29］。但是血小板激活并释放生长因子是一个复杂的过程，血小板数量的增加并不能立即使所有生长因子浓度相应升高，PRP体内最佳作用浓度、生长因子释放的顺序和调节机制有待进一步研究。PRP内各因子的相互作用，促进成骨的机制尚未完全阐明。此外，有些学者对PRP的治疗效果仍持怀疑态度。如Kim等［30］提出应用PRP所出现的良好临床效果，也可能是纤维蛋白凝胶的形成和周围结缔组织增生所引起的快速的软组织愈合，从而减少了伤口裂开和局部感染的概率。因此，PRP促进骨修复的临床效果仍需要更深入的研究及大量的证据来证明。

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