不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究
发表时间：2010-02-03 浏览次数：534次
不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究作者：刘君，向川，卫小春 作者单位：山西医科大学第二医院骨科，山西 太原 【摘要】 目的 探讨不同加样方法对逆转录病毒转染软骨细胞效率的影响。方法 将构建并包装好的逆转录病毒重组基因PLNCX2IL1RaGFP分别采用以下加样转染方法进行转染并作对照研究，a)第1组：先加病毒上清，6 h后补充培养液；b)第2组：先加病毒上清，隔夜补充培养液；c)第3组：先加病毒上清，6 h后更换成培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后更换成培养液；d)第4组：先加病毒上清，6 h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后补充培养液；e)第5组：经典转染法，同时加病毒上清液和培养液。转染2 d后免疫荧光显微镜下观察荧光显色，4周稳定转染后分别检测各组细胞培养液中NO含量，并用ELISA法检测上清液中hIL1Ra的表达情况。结果 酶切鉴定重组基因正确；免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色；1～5组NO含量以第4组为最高，第5组为最低；ELISA检测1～5组培养液中hIL1Ra的含量以第4组为最高，第5组为最低。结论 四种不同加样转染方法的转染效率均高于经典法，其中以第4组为最好。 【关键词】 转染方法；逆转录病毒；转染效率 Experiment Study of Retrovirus Transfected Efficience with Several Addingsample Methods LIU Jun，XIANG Chuan，WEI Xiaochun (Second hospital of Shanxi Medical University，030001，Taiyuan，Shanxi，China) Abstract：Objective To study effect of retrovirus transfected efficience on articular chondrocytes with several addingsample methods.Methods With following adding.methods，using constructed and packaged retrovirus carrier PLNCX2IL1RaGFP transfect articular chondrocytes，and making control study.1，adding virus supernatant，culture medium was complemented after 6 hours.2，adding virus supernatant firstly，complementing culture medium on the second day.3，adding virus supernatant，replaceing the virus supernatant with culture medium after 6 hours，quiting medium after culturing overnight，and then adding virus supernatant，replaceing the virus supernatant with culture medium.4，adding virus supernatant firstly，complementing culture medium after 6 hours，quitting medium after culturing overnight，and then adding virus supernatant，culture medium was complemented after 6 hours.5，the classical transfected method：adding virus supernatant and culture medium on the same time.To observe fluorescence color with immunofluorescence microscope after transfecting 2 days.Testing the NO content of each group′s culture medium after transfecting stably about 4 weeks，and detecting expression of hIL1Ra in supemate by ELISA.Results Enzyme digestion identificated the recombination was correct.To observe green fluorescence with immunofluorescence microscope.Among the NO content from 1 to 5 group，the highest is 4 group and the lest is 5 group，There is statistical significance in comparison between any two means.Among the hIL1Ra content from 1 to 5 group，the highest is 4 group and the lest is 5 group.There is statistical significance in comparison between any two means.Conclusion Four adding methods′transfecting efficiency was higher than classical method. Key words：transfect methods；retrovirus；transfecting efficiency 随着基因工程的发展，基因转染越来越多地应用到临床和科研领域。但是如何能够最大程度地提高基因转染效率成为众多学者首先要突破的瓶颈。对于转染效率较高的逆转录病毒来说，鉴于病毒自身的生物学特性，不同的加样方法，必然会导致不同的转染效率，本研究采用五种不同的加样方法，探讨最佳的加样转染方法，为提高病毒载体的转染效率提供理论基础。1 材料和方法 1.1 材料 载体PLNCX2、pDsRed于Clontech公司生产，pCDNA3.1GFP为本课题组前期构建并保存；Il1Ra基因从正常人脑组织cDNA文库中扩增，扩增模板是购自BD的正常人脑组织cDNA文库质粒；XhoI、HindIII、BamHI限制性内切酶、T4DNA连接酶(TaKaRa)；小鼠肾成纤维细胞系NIH3T3，包装细胞系PT67(Clontech公司)；细胞培养液EMDM/F12(Hyclone)；消化酶、胎牛血清(四季清公司)；G418(Gbico公司)；聚凝胺Polybrene(中山生物工程有限公司)；真核细胞转染试剂LipofectAMINE2000Reagent(Invitrogen公司)；ELISA检测Il1Ra试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；感受态大肠杆菌、Ⅱ型胶原酶、Protease E、胰酶(大连宝生物有限公司进口分装)；新西兰大白兔购于太原畜牧所。 1.2 方法 1.2.1 逆转录病毒载体PLNCX2IL1RaGFP的构建 载体PLNCX2经XhoI/HindIII双酶切，去磷酸化后，与载体pCDNA3.1GFP(－)经XhoI/HindIII双酶切得到的多克隆位点和GFP基因在T4DNA连接酶的作用下连接，构建成PLNCX2GFP。Il1Ra基因从正常人脑组织cDNA文库中扩增，胶回收，经XhoI/BamHIII双酶切后，与经XhoI/BamHIII双酶切的PLNCX2GFP，在T4DNA连接酶的作用下连接，构建成PLNCX2Il1RaGFP。 1.2.2 逆转录病毒载体的包装及病毒上清滴度的检测［1］ 采用脂质体介导转染法将重组质粒PLNCX2Il1RaGFP转染到生长至80％融合时的包装细胞PT67上(具体操作方法见真核细胞Lipofect AMINE 2000 Reagent转染试剂盒)，用G418筛选培养14 d，待转染细胞形成抗性克隆后挑选出扩增培养、传代、收集各克隆1～4代的病毒上清，过滤后分装－70°冻存。取6孔培养板，每孔加入2×104个NIH3T3细胞株，细胞生长至80％融合时，加入1∶100稀释的阳性克隆病毒液3 mL，培养4 h后换用300 μg/mL的G418筛选液培养4周，计数存活的抗性克隆，根据公式计算病毒上清滴度。 1.2.3 兔膝关节软骨细胞的培养 无菌条件下截取3个月龄新西兰大耳白兔膝关节，洁净工作台内将膝关节打开，利刀将软骨取下，切成约1 mm×1 mm×1 mm的碎块。无菌Hank′s液冲洗，2000 rpm，5 min，弃上清，称重，得知软骨质量。按12 mL/g软骨比例用菌0.4％Pronase(链霉蛋白酶)37℃消化90 min后，600 rpm，5 min，弃上清。按12 mL/g软骨比例用无菌0.025％Ⅱ型胶原酶37℃消化过夜，1200 rpm，10 min，弃上清，加DMEM/F12吹打冲洗，1400 rpm，4 min，弃上清。无菌Hank′s液冲洗，100 pm及40 pm滤膜过滤。细胞记数后(胎盼蓝染色细胞活度大于90％)，按1×105/mL浓度接种于含有盖玻片的六孔板，加入常规原代细胞培养液(DMEM/F12)，10％胎牛血清，置于37℃，5％CO2培养箱内进行原代培养。 1.2.4 逆转录病毒转染软骨细胞分组情况 将生长于对数增长期的兔膝关节软骨细胞分为5组，并按照以下方法进行转染，a)第1组：先加病毒上清，6 h后补充培养液；b)第2组：先加病毒上清，隔夜补充培养液；c)第3组：先加病毒上清，6 h后更换成培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后更换成培养液；d)第4组：先加病毒上清，6 h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后补充培养液；e)第5组：经典转染法，同时加病毒上清液和培养液。分别收集转染后72 h的细胞上清液，并冻存待检。 1.2.5 免疫荧光倒置显微镜观察转染情况 转染后48 h，在无菌条件下将细胞培养板放置在免疫荧光倒置显微镜下观察荧光情况。 1.2.6 NO含量检测(硝酸还原法) 将收集好的各组细胞培养上清液，按照一氧化氮检测试剂盒说明书进行操作。 1.2.7 酶联免疫吸附(ELISA) 分别检测各组细胞培养上清液中IL1Ra的表达情况，具体操作参照ELISA检测试剂盒说明书。 1.2.8 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间均数比较采用单因素方差分析，计算总体差异并进行两两比较，P＜0.05为差异有显著性意义。2 结 果 2.1 逆转录病毒载体PLNCX2IL1RaGFP的构建、包装和滴度测定 重组基因PLNCX2IL1RaGFP经酶切鉴定测序，Il1Ra、GFP序列均正确，基因可以通读。转染到包装细胞并筛选培养后，转染NIH3T3细胞并计算病毒滴度为1×106 C.F.U。 2.2 分组转染后倒置荧光显微镜下观察 倒置荧光显微镜下观察细胞，可见明显的绿色荧光反应，证明转染成功，见图1～2。 2.3 转染后细胞培养液中NO的含量测定 采用NO检测试剂盒检测1～5组的NO含量：a)第1组为(95.92±6.23) μmol/L；b)第2组为(111.48±6.12) μmol/L；c)第3组为(132.59±5.49) μmol/L；d)第4组为(155.47±7.77) μmol/L；e)第5组为(89.77±4.73) μmol/L。其中以第4组为最高，第5组为最低，两两比较均有统计学意义(P＜0.05)。 2.4 ELISA检测目的基因的表达及其转染效率的鉴定 ELISA检测各组上清液中IL1Ra的表达情况，1～5组培养液中hIL1Ra的含量：a)第1组为(48.97±3.74) ng/L；b)第2组为(55.43±3.94) ng/L；c)第3组为(59.73±3.64) ng/L；d)第4组为(65.47±4.60) ng/L；e)第5组为(42.13±3.38) ng/L。其中以第4组为最高，第5组为最低，两两比较均有统计学意义(P＜0.05)。3 讨 论 病毒类载体在基因转染中是最常见的载体之一，特别是逆转录病毒载体。鉴于其能稳定地整合入宿主细胞染色体内，尤其包装后的载体转染效率大大提高，具有宿主范围广等优点，因此，世界各地的学者们都在积极的研究这一具有潜力的载体，并且得到了比较乐观的结论。Cone和Karlsson等人均用逆转录病毒表达载体实现了人珠蛋白基因的正确表达［2］。Otani等［3］用逆转录病毒将IL1Ra基因直接注入兔关节炎模型中，发现软骨基质分解和蛋白多糖合成抑制的情况由于基因转染而有所削弱，且以促进蛋白多糖合成的作用最为显著。张晓玲等［4］也证明了逆转录病毒能介导人IL－1Ra 在关节滑膜细胞中稳定表达，同时芮云峰等［5］也用逆转录病毒介导IL1Ra和IL10联合转染人软骨细胞并获得理想的稳定表达。另外在肿瘤、血液病及其肝脏疾病的治疗中也得到了广泛应用。然而，困扰各位学者的瓶颈之一无疑是病毒转染的低效率问题，作者从病毒类的侵蚀特性出发，分别采用不同的加样方法进行转染，从而寻找突破口。实验发现先加病毒上清，6 h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后补充培养液的加样方法进行转染后，目的基因的表达量明显高于其他转染方法，进而说明了该方法的转染效率最好，为逆转录病毒载体的广泛应用打下理论基础。【参考文献】［1］Fredrick MA，Kingston KE.精编分子生物学实验指南［M］.第4版.北京：科学出版社，2006：351354.［2］邱丽筠，俞淑文，张芳，等.基因治疗载体的最新研究进展［J］.中华实用医药杂志，2004，4(1)：1218.［3］Otani K，Nita I，Macaulay W，et al.Suppression of antigeninduced arthritis in rabbits by ex vivo gene therapy［J］.J Immunol，1996，156(9)：35583562.［4］张晓玲，于长隆，毛泽斌，等.逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL1Ra 在关节滑膜细胞中的表达［J］.体育科学，2005，25(7)：2124.［5］芮云峰，王友，张晓玲，等.白细胞介素1受体拮抗蛋白和白细胞介素10联合基因转染人骨关节炎软骨细胞的研究［J］.中华实验外科杂志，2007，24(11)：14071410.
