Rho/Rho-kinase信号转导通路和对缺血性脑血管病的神经保护

　　作者：石元洪,徐金枝,张苏明　　作者单位：华中科技大学附属同济医院神经内科 武汉 430022;九江学院附属医院神经内科 九江 332000

　　2005年，Bernhard K[1]等在《NATURE》上撰文指出，Rho/Rho-kinase信号通路在脑梗死等神经系统疾病的病理机制中扮演着重要角色;因而Rho-kinase抑制剂是一类很有希望的神经系统靶点药物。自此，有关Rho/Rho-kinase信号通路在神经系统疾病发病中的机制和其抑制剂的神经保护作用的实验和临床研究方兴未艾。本文旨在对Rho/Rho-kinase的分子生物学特征、Rho/Rho-kinase信号通路的分子调节机制、下游效应分子的生理作用和Rho/Rho-kinase抑制剂对脑梗死的神经保护作用作一系统总结。

　　1 Rho/Rho-kinase的分子生物学特征 Rho/Rho-kinase信号通路的成分主要有三个：小G蛋白(在这里主要是指Rho)、与Rho相连的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效应分子。

　　1.1 Rho蛋白 1971年，Rodbell、Cassel、Schramm等在研究中发现了G蛋白，从此开辟了跨膜信号转导机制研究的新纪元。G蛋白的种类很多，但是它们有一些显著的共同特点，如活性受GTP调节，由三个亚基组成，是膜蛋白等。Rho蛋白是G蛋白中的一种，是Ras超家族成员中的一个。由于这类蛋白分子相对其它的G蛋白小，故又称小G蛋白。其实，除了分子量小之外，小G蛋白还有许多不同于G蛋白的一些特性，如一般只有一个亚单位，其酶活性需要其它的调节因子，存在于胞质中(活化时转移到质膜上)，功能与信息转导、细胞的生长、分化、迁移以及炎性细胞的黏附、吞噬等有关。

　　Rho亚家族属于小G蛋白超家族成员，其分子量约20～30Kd，由氨基酸序列高度同源的3 种异构体组成：RhoA、RhoB、RhoC。Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式两种状态存在于细胞质中[2]质膜上。

　　RhoA是第一个被鉴定的Rho家族成员(1985年)[3]，之后发现众多的家族成员。在人类，23种基因拼接至少26种不同的蛋白，按照氨基酸序列的同源水平不同，将这些蛋白分为6个亚家族：Rho( RhoA、RhoB、RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3、RhoG)、Cdc42(Cdc42Hs、G25K、TC10)、Rnd( RhoE /Rnd3、Rnd1 /Rho6、Rnd2 /Rho7)、RhoBTB、和RhoT/Miro。

　　1.2 Rho-kinase ROCK，即Rho激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，以两种同源性极高的异构体存在：ROCKⅡ(ROCKα)和ROCKⅠ(ROCKβ)，是目前研究最为清楚的Rho下游效应分子。Rho激酶包括一个催化区(位于分子结构的N端)，一个螺旋区(位于分子结构的中间部分)及一个pleckstrin同源区( PH区，位于分子结构的C端) 。Rho激酶的Rho结合区( Rho-binding， RB ) 位于螺旋区的C 端。Rho-GTP与螺旋区的C端相互作用，并激活Rho激酶的磷酸转移酶活性。Rho激酶的C端(包括RB和PH区)为激酶的负向调节区。在静息状态下， RB 和PH区与激酶的催化区相互作用，并抑制激酶的活性。激活状态的Rho与RB相互作用，改变了Rho激酶的构型，从而解除RB和PH对激酶的抑制，Rho激酶被激活。激酶缺失C端区，包括PH区或PH与螺旋区， 可使激酶持续激活。某些化学制剂， 如Y227632、HA1077 ( fasudil)或hydroxyfasudil等，能够以与ATP竞争的方式特异性地抑制Rho激酶的活性。它们与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，从而抑制Rho激酶的活性。除了Rho激酶，蛋白激酶N( p rotein Kinase N， PKN ) 、rhophilin、rhotekin、citron、p140mDi和citron激酶都是Rho的下游效应器[4]。

　　1.3 Rho-kinase的效应分子 当Rho/Rac蛋白被激活，就转移到特定的细胞亚结构上，它们将与下游效应分子交互作用，激发特定的信号级联。至今，有70多个蛋白被鉴定属于Rho/Rac蛋白的下游效应分子。从结构上看，这些效应分子把Rho/Rac蛋白的开关区域Ⅰ、Ⅱ部分的特定残基作为主要的锚着/识别位点[5]。

　　Rho激酶的下游底物虽然很多，但是被深入研究的并不是很多。其中球蛋白轻链磷酸化酶(myosin light-chain phosphase，MLCP)是目前研究得最多也是最清楚的Rho激酶作用的底物之一。MLCP的肌球蛋白结合亚基(myosin-binding subunit，MBS)是第一个被确认的Rho激酶的底物。MLCP包括3个亚基：MBS， 37kDa的1型磷酸化酶催化亚基、肌球蛋白结合亚基(MBS130k) 即磷酸酶靶蛋白I(MYPT-1) 调节亚基和一个功能不明的小M20非催化亚基。MLCP通过MBS与磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)结合，并使其脱磷酸。Rho激酶激活后可磷酸化MBS，从而导致MLCP失活。Rho激酶还可以直接磷酸化MLC。所以， Rho激酶可通过直接磷酸化MLC及使MLCP失活两种途径调节MLC的磷酸化水平。Rho 激酶后MLCP的活性受到抑制，导致MLC磷酸化水平升高和平滑肌细胞收缩，产生严重的血管痉挛。而Rho激酶的这种作用可以被Rho激酶抑制剂所逆转。再就是研究较多的蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛的机制之一和Rho激酶抑制剂治疗血管痉挛的理论依据。

　　还有一个Rho激酶的作用底物研究也较多：内皮源性一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)。他们的研究认为，脑缺血等使Rho激酶活化，使eNOS下调，引起血管收缩，脑血流下降;内皮功能及屏障受损，使梗死加重。对动脉粥样硬化等慢性血管的受损可能也有很重要的作用。

　　2 Rho/Rho-kinase信号通路的分子调节机制

　　为确保对细胞外刺激的正确反应，细胞通过许多调节方式控制Rho/Rho-kinase的活性：①通过调节鸟苷酸转换因子(Guanosine nucleotide exchange factor，GEFs)和GTPase激活蛋白(GTPase activating protein，GAPs);②调节亚细胞定位;③调节蛋白表达水平;④其它调节方式。

　　2.1 GEFs和GAPs对Rho活性的调节 Rho在信号通路中扮演一种“分子开关”的角色，总是在激活和失活状态之间转换。是激活状态或失活状态，有赖于与之连接的是GDP还是GTP。调节这种循环的是至少有3类蛋白：GEFs 、GAPs和GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor， GDI)。GEFs促使GDP从Rho上分离而结合GTP，在信号转导中激活Rho活性;GAPs激活小G蛋白的内源性GTP酶活性，水解GTP成GDP;GDIs抑制GDP与GTP的转换和GTP的水解。GEFs 和GAPs的活性受上游胞外刺激因子的调节[6]。ERM ( ezrin / radixin /moesin) 家族、溶血磷脂酸( lysophosphatidic acid，LPA)和凝血酶可促进凝血酶蛋白的活化;活化的凝血酶可激活Rho;而来源于肉毒菌的C3转移酶则使RhoG蛋白核糖化，抑制RhoG蛋白的生物学活性并限制其移位至胞膜。

　　2.2 通过定位亚细胞结构来调节Rho/Rho-kinase的活性 Rho蛋白必须锚着于胞膜或其它亚细胞结构才能发挥生物学功能。锚着过程是靠内在性链接信号以及信号间的协调了完成的。而链接信号最关键的是进行后翻译修饰过程，也就是所谓的GTPase“CAAXbox”。这个修饰过程的开始阶段是将geranyl-geranyl结合到半胱氨酸残基上，而且整个过程由geranyl-gerany所催化。之后，GTPase转移到内质网上，在那里AAX三肽尾的裂解是通过isoprenyl即CAAX-特定酶Rce1完成的。这个反应结束后，C-末端半胱氨酸残基的α-羧基暴露，并被羧基甲基转移酶甲基化[7]。对大多数Rac超级族而言，geranyl-gerany的结合的膜锚着和Rho/Rho-kinase激活的必要条件，相反，甲基化仅对GTPase的亚细胞定位有关[8]。

　　Rho蛋白还需要另外的上游信号使其从胞质转移到靶膜上并牢固地锚着。GDIs在这种调节中发挥重要作用，它隐藏GTPase的isoprenyl基，从而隔离胞质和细胞器上的非活性的GTPases，并在最后的信号过程中将GTPases从质膜上移走也很重要。由于RhoGDIs与GTPases开关区域的相互作用，阻止GDP从GTPases上释放，因而起到在非刺激细胞中保持GTPase处于失活状态[9]。

　　RhoGDIs从GTPase上解离的过程(对GEFs激活GTPases和随后的与质膜的连接都是非常重要的)在信号转导中在不同水平被调节。这些调节过程在Rac1中已经研究得很清楚：整合子(integrins)增加Rac对脂质膜的亲和力，在RhoGDI疏水口袋中取代GTPase的geranyl-geranyl基序并插入靶目标磷脂双分子层[10]。

　　2.3 转录调节 许多Rho/Rac GTPases显示出细胞特异性和/或刺激依赖性表达，例如Rac2主要限于造血细胞，Rac3主要表达于神经节和中枢神经系统[11]。RhoB的表达可受胞外刺激如紫外线、细胞因子和癌基因等调节[12]。一些Rho/Rac蛋白通过在细胞不同的特定位点降解而调节，这种调节有利于控制细胞在迁移过程中张力丝导向的不适当形成[13]。

　　2.4 Rho/Rac 蛋白效应分子的调节 Rho/Rac GTPase激活后可激活下游效应分子，激活的效应分子被链接到质膜上的信号热点区域[14]。效应分子的交互作用引起分子构象变化，使它们从抑制状态到完全激活状态。这种调节方式的效应分子包括催化性的如ROCk、Pak等和非催化性的如Was等。有时还需要其它的信号协同作用而达到最佳的活化状态，如Pkn需要RhoA等的偶联才能被完全激活。一些下游信号成分也可能被位于GTPase结合的抑制因子的释放而激活[15]。

　　效应分子的激活可以反过来作用于GTPases，从而对Rho/Rac蛋白的作用产生信号和时间的限制。Pak蛋白家族在这种调节中异常活跃，它们可以改变RhoGDIs和Rho/RacGEFs的活性，这就造就了GTPases信号转导通路上的高度可塑性和大量的反馈环路[16]。

　　3 Rho/RacGTPase的在体功能研究

　　Rho/Rho-kinase信号转导通路的在体功能研究目前主要采取同源染色体重组技术和特定基因缺失或敲除来造模动物。

　　3.1 Rac亚组成员的在体功能 Rac1基因缺失引起胚胎死亡，原因是原肠胚形成障碍和中胚层细胞调亡，其它亚家族成员基因缺失在这方面的引起的障碍很轻微。Rac2-1-引起造血细胞障碍，rac1-1-引起运动失调和增强学习能力[17]。Rho-1-的T细胞对抗原的反应过于激烈[18]。Rac1和Rac2在调节造血干细胞的作用上亦有不同：Rac1使造血干细胞在胞外刺激下进人细胞增殖周期，依次经过S期和G2/M期;Rac2在造血干细胞的聚集、黏附、迁移和保持成活上发挥作用[19]。

　　对T细胞，Rac-1-小鼠T细胞在胸腺分化中没有明显的异常，但是成熟的T细胞却存在明显的障碍，如受体聚集、钙外流等。总的说来，GTPase有如下作用：T细胞识别、阳性和阴性选择、磷脂酰醇3酶的激活和对抗原的反应等[20]。

　　对B细胞，Rac2异常动物出现周边B细胞数减少和分泌型IgM缺失等。成熟的Rac-1-中的B细胞对受体刺激反应减弱、钙流水平下降、增殖受到抑制等。敲除Rac1和Rac2基因将使B细胞发育停滞在不成熟的阶段[21]。

　　无Rac表达的动物，中性粒细胞的活力、黏附、趋化性和吞噬作用严重受损。Rac-1-的中性粒细胞的障碍较轻[22]。Rac2与巨噬细胞的吞噬、趋化和迁移作用有关，Rac1则调节巨噬细胞的形态和伪足的形成[23]。Rac1在血小板中高水平表达，与血小板的伪足形成、迁移、聚集和血栓形成等有关[24]。

　　Rac1在神经系统中的髓鞘形成中发挥重要作用，还与脊髓发育中的运动神经元和联络神经元的迁移、分化、轴性化、神经管尾端的闭合有关。Wasf2基因异常的动物胚胎生长迟滞、脑室畸形。Wasf-1-发育正常，但是个小、焦虑、运动感觉迟钝、学习记忆力下降[25]。

　　3.2 Rho亚组成员的在体功能 RhoB和RhoC缺失的小鼠的活力、生殖能力增强。RhoB对细胞的运动很重要，但对细胞的黏附、迁移无关。RhoB对肿瘤一抑制作用。RhoC-1-肿瘤细胞代谢低、迁移能力下降[26]。RhoA的ROCK1、2与动物胚胎眼睑闭合、腹侧体壁的融合有关;它的效应分子cit-1-致动物出生后1月可出现癫痫发作，精子产生障碍而引起睾丸功能严重异常[27]。

　　3.3 Cdc42亚组成员的在体功能 Cdc42d功能与磷脂酰肌醇二磷酸酯介导的肌动蛋白的聚合有关，缺失将导致细胞骨架断裂、细胞形态改变、变小[28]。Cdc42-1-可导致细胞极性缺陷，包括细胞在迁移过程中失方向和在高尔基器内失定位。另外，它对少突胶质细胞形成髓鞘很重要，而对干细胞的黏附、细胞周期的调节和细胞骨架的作用不明显。许多cdc42的效应发作也已经探明：was缺失小鼠的胸腺细胞减少，成熟的淋巴细胞、血小板也下降。Was-1-小鼠在年老时易患肠炎，lqgap-1-的胃壁细胞过度增生，提示cdc42可能会抑制肠上皮增生。

　　4 Rho/Rho-kinase抑制剂对缺血性脑血管病的神经保护作用

　　4.1 Rho/Rho-kinase信号通路在缺血性脑血管病发病中的作用 从上面的资料可以看出，Rho/Rho-kinase信号转导通路在神经系统中与许多重要的生理、病理活动有关。它不仅在个体的发育中发挥重要作用，而且参与许多疾病的发病机制，目前研究较多的是蛛网膜下腔出血、脑梗死、精神发育迟滞和痴呆等。

　　近几年有关Rho/Rho-kinase信号转导通路在脑梗死的发病机制中的作用的动物和临床研究越来越多。但是大多数的研究都是基于应用Rho-kinase抑制剂来改善脑缺血引起的神经功能缺损来判断其对脑梗死的神经保护作用，从而间接推断Rho/Rho-kinase信号转导通路在脑梗死发病中的机制。而这种研究又多集中在两个方面：通过对血管平滑肌和血管内皮细胞的作用来扩张血管，改善血流动力学。但是Rho/Rho-kinase信号转导通路在脑梗死发病过程中怎样启动缺血引起的神经损害、哪些因素参与激活Rho-kinase以及下游效应分子、激活的具体分子机制等研究较少。这也可能是将来很重要的研究方向。

　　另外，有一些文献报道ROCK在动脉粥样硬化形成中的重要作用(例如对血管平滑肌、炎性细胞、血管内皮细胞的作用以及细胞凋亡机制、对血管紧张素Ⅱ的作用等)，以及参与2型糖尿病胰岛素抵抗的分子机制，可能对解释动脉粥样硬化引起的脑梗死和慢性脑缺血的机制很有意义[29]。但是，这种研究多是集中在心血管病和肾脏疾病上。

　　不难看出，由于Rho/Rho-kinase信号转导通路介导的生物学效应异常繁多，以及应用Rho-kinase抑制剂能很好地改善缺血的症状和神经功能，Rho/Rho-kinase信号转导通路无论是在慢性脑缺血还是急性脑梗死的发病机制中都扮演着非常重要的角色。

　　4.2 Rho/Rho-kinase抑制剂对急性脑梗死的神经保护作用 近3年这方面的临床和动物实验研究有增多趋势，而在此之前，Rho-kinase抑制剂在神经系统中的应用多集中在蛛网膜下腔出血的迟发性脑血管痉挛上，可能与最早应用到临床的Rho-kinase抑制剂法舒地尔最早的推出是治疗血管痉挛有关。但是后来的实验证明，Rho/Rho-kinase信号转导通路下游效应分子多样性以及RhoGTPase不仅仅表达在血管平滑肌还广泛分布在神经系统的其它组织，于是它的应用范围逐渐扩大。脑梗死作为神经系统常见病，致残率和死亡率都很高，而目前还没有非常有效的治疗方法，所以Rho-kinase抑制剂对脑梗死的神经保护作用的研究就变得非常重要而有意义了。

　　法舒地尔(fasudil，FH，又称HA1077和HT877)是目前唯一应用到临床和在实验中最常用的Rho-kinase抑制剂，由日本研制于1995年被批准上市。FH的代谢产物之一羟基法舒地尔(hydroxyfasudil)的活性和特异性比原药更高。作为蛋白激酶抑制药，FH还在细胞水平调节细胞增殖、迁移黏附、骨架重排、胞浆移动、炎症细胞运动等，在分子基因水平调节炎症、血栓形成、氧化、纤维化等相关的多种因子。

　　Satoh S[30]等用沙土鼠造模脑梗死，在急性缺血后分别于24和48h给予FH(两种剂量10mg/kg和30mg/kg)，每天两次，并与氯吡格雷和依达拉奉作为对照。结果显示在缺血24h后给药，FH能有效缩小梗死面积，改善神经功能缺损，而且呈剂量依赖性。因而认为FH相对宽的治疗时间窗，将在缺血性脑梗死上发挥非常重要的作用。

　　Rikitake Y[31]的研究表明，脑梗死后ROCK活性较对照组明显增强，应用FA在体和离体血管内皮细胞的内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)活性增加，局部NO增高，脑血流增加，脑梗死面积缩小，神经功能改善。因而认为FH对脑梗死的神经保护作用不仅仅通过血管平滑肌的扩张血管的作用，而对内皮细胞的作用如扩张血管、维持内皮细胞的结构和功能的完整性等是另外一条重要的途径。Yagita Y[32]的在体研究也表明急性梗死缺血会激活Rho激酶活性，下调eNOS活性，使梗死面积扩大，而且这种效应可以被Rho激酶抑制剂所逆转。

　　Feske SK[33] 等经过研究后认为，RhoGTPase在脑内广泛分布，因而Rho激酶抑制剂对脑梗死的缺血保护作用体现在促进神经轴突的生长、增加脑血流量、减少梗死面积、减少中性粒细胞等炎性细胞和炎性介质的聚集和释放、保护缺血性神经元的丢失;降低因缺血诱导的Rho激酶激活使血脑屏障通透性增加的作用。

　　总的说来，RhoGTPase在神经系统中除了分布在血管平滑肌以外还广泛地分布于血管内皮细胞等多种脑组织中，Rho/Rho-kinase信号转导通路在脑梗死发病中可能参与多种生物学效应：血管收缩使血流进一步减少、氧自由基生成、钙超载、细胞调亡、激活炎症过程以及对细胞定向分化、神经髓鞘的形成、轴突和树突的定向迁移和联络的影响等，甚至可以认为它是缺血神经损伤的细胞分子水平机制的中心枢纽。Rho激酶抑制剂对急性脑梗死缺血的保护作用是显而易见的，它在临床上的应用开辟了一条有效治疗脑梗死的全新的途径，而且随着研究的进一步深入，这种治疗效果可能会进一步提高。但是就目前而言，除了FH以外，还没有其它的Rho激酶抑制剂应用到临床。另外，目前大多数Rho激酶抑制剂都是非选择性的，而RhoGTPase的不同亚型在脑组织中的分布不同，所介导的生物学效应亦不同，所以应用选择性的Rho激酶抑制剂针对特定的病理过程将是将来研究的重点和方向。Rho/Rho-kinase信号转导通路中繁多的下游效应分子和调节方式，为特异性Rho-kinase抑制剂的开发和治疗神经系统疾病提供了无限广阔的应用前景。

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